Использование EpiAirway модель Характеризуя Долгосрочные хост-возбудителя Взаимодействия

Общая цель следующего эксперимента заключается в проведении длительного совместного культивирования нетипируемой гемофильной палочки (Nontypeable Hemophilus influenza или NTHI) с первичными тканями респираторного эпителия человека с использованием модели эпи-дыхательных путей. Это достигается путем инокуляции апикальной поверхности NTHI, что на втором этапе позволяет бактериям прикрепиться к тканям и проникнуть в них. Вставки промывают каждые 24 часа предварительно нагретым DPBS для имитации нормального тока слизи и удаления продуктов распада муцина, а также любых клеточных остатков.

Затем ткани собирают в выбранный временной точке и определяют выживаемость общего количества ассоциированных с клетками или интернализованных NTHI. Наконец, с помощью этого метода можно оценить штамм-специфические характеристики выживаемости NTHI в тканях с течением времени на основе подсчета жизнеспособных бактерий. Данный метод позволяет получить представление о долгосрочных инфекциях, вызванных нетипируемой гемофильной палочкой.

Этот метод также может быть использован при изучении других патогенов человека, таких как Moraxella. Демонстрацию данной процедуры проводит доктор Доин, постдокторант моей лаборатории. Извлеките транспортный планшет из упаковки и подготовьтесь к началу эксперимента. Обработайте транспортный планшет 70% ethanol и поместите его в бокс биологической безопасности.

В каждую лунку шестилуночного планшета внесите по 1 мл поддерживающей среды для epi airways, охлажденной до 4 °C. Затем снимите фиксирующую ленту, откройте планшет и удалите марлевую салфетку, прикрывающую вставки epi airway. С помощью пинцета, используя вращательное движение, извлеките вставку из упаковки.

Поместите вкладыш в одну из лунок шестилуночного планшета. При необходимости используйте стерильный ватный тампон, чтобы осторожно удалить излишки среды из вкладыша, стараясь не касаться мембраны. Убедитесь, что под вкладышами не осталось пузырьков воздуха.

Затем поместите планшет на шесть лунок в инкубатор. Промывайте вставки ежедневно следующим образом: предварительно нагрейте DPBS с кальцием и магнием и наберите DPBS в наконечник. Затем, используя стерильный пинцет, аккуратно поднимите вставку и пипеткой нанесите 200 µL предварительно нагретого DPBS на ткань.

Затем аккуратно покачайте вкладыш, чтобы равномерно распределить DPBS, не касаясь ткани. После этого наклоните вкладыш под углом и прислоните наконечник дозатора P 1000 к пластиковому кольцу, удерживающему мембрану в нижней части вкладыша. Затем осторожно аспирируйте буферный раствор и перенесите его в криопробирку для последующего анализа.

Наконец, аспирируйте поддерживающую среду и замените её одним миллилитром свежей среды. Предварительно нагрейте дополнительный объем DPBS с кальцием и магнием. Добавьте три миллилитра подогретого DPBS в пробирку объемом 15 миллилитров, после чего ресуспендируйте в пробирке отдельные колонии нетипируемого гриппа или NTHI, выращенные в течение ночи на шоколадном агаре.

Теперь интенсивно перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение не менее 10 секунд, после чего измерьте оптическую плотность. Продолжайте добавлять отдельные колонии NTHI до тех пор, пока концентрация бактерий не достигнет значения OD 600 нанометров примерно 0,7. Затем промойте каждый вкладыш с эпителием дыхательных путей предварительно нагретым DPBS, как описано ранее, и добавьте 28 microliters бактериальной суспензии на апикальную поверхность каждого вкладыша.

Избегайте инокуляции базовой поддерживающей среды. Затем верните планшет в инкубатор для количественного определения NTHI; предварительно прогрейте, а затем высушите поверхность чашек с шоколадным агаром. Далее проведите серийное разведение инокулята NTHI, используя стерильный PBS с 0,1% желатина или PBSG.

Нанесите по 10 µL аликвот инокулята на планшеты, затем инкубируйте их в течение ночи при 37 °C в атмосфере 5% CO2. На следующий день определите количество КОЕ на мл, подсчитав количество четко разделенных колоний (от 15 до 30) в каждой капле соответствующего разведения, и рассчитайте общее количество жизнеспособного инокулята NTHI для определения общего числа ассоциированных с клетками бактерий. Промойте апикальную поверхность эпителия дыхательных путей трижды, используя по 200 µL DPBS без кальция и магния.

Затем наклоните вставку и промойте базальную мембрану от остатков поддерживающей среды. Поместите промытую вставку в новый планшет на шесть лунок и добавьте 250 µL стерильного 1% раствора сапонина на апикальную поверхность каждой ткани. Верните планшет в инкубатор на 10 минут для инкубации.

Подготовьте пробирки для серийного разведения, наполнив каждую из них 900 µL PBSG. Затем соскребите ткань с мембраны наконечником дозатора P 1000, совершая возвратно-поступательные, а затем круговые движения, чтобы удалить ткань с краев вставки. После этого с помощью стерильного наконечника P 1000 с широким отверстием перенесите суспензию в пустую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Теперь добавьте 250 µL DPBS на апикальную поверхность вставки, после чего осмотрите вставку с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа, чтобы определить, осталась ли ткань для сбора. Перенесите суспензию в пробирку типа «эппендорф» и добавьте 500 µL DPBS, интенсивно перемешивая. Вортексируйте клеточную суспензию в течение одной минуты.

Затем, используя стерильный шприц объемом 1 мл с иглой 26G, наберите суспензию в шприц через иглу. Медленно пропустите суспензию через иглу три раза, стараясь не создавать пузырьков воздуха.

Затем интенсивно перемешайте суспензию на вортексе еще в течение одной минуты. Далее с помощью наконечника для пипеток с широким отверстием перенесите 100 µL суспензии в первую пробирку для разведения. Интенсивно перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение пяти секунд, после чего выполните серийное разведение от 1 до 10 и высейте разведения на чашки с шоколадным агаром.

Затем инкубируйте планшеты в течение ночи при 37 °C в атмосфере 5% CO2 для подсчета жизнеспособных бактерий с целью сбора интернализованных бактерий. Промойте каждый вкладыш трижды 200 µL DPBS. Замените поддерживающую среду в базальном отделении на среду, содержащую 100 µg/mL сульфата гентамицина, затем добавьте 300 µL поддерживающей среды с гентамицином на апикальную поверхность.

Верните вставки в инкубатор на один час; пока вставки инкубируются, предварительно подогрейте DPBS. Затем удалите поддерживающую среду, содержащую гентамицин, с апикальной поверхности. После этого тщательно промойте апикальную поверхность и базальную мембрану вставок предварительно подогретым DPBS.

Наконец, повторите только что продемонстрированную процедуру отмывки и сбора перед проведением серийных разведений и посевом интернализованных бактерий, представленных на этом рисунке. Сравнение изображений сканирующего электронного микроскопа неинфицированных тканей эпителия дыхательных путей слева и тканей эпителия дыхательных путей, инфицированных NTHI в течение пяти дней, справа. Видно, что длительное совместное культивирование с NTHI не приводит к значительным повреждениям апикальных тканей, что подчеркивает эффективность модели эпителия дыхательных путей.

Здесь представлен график, отображающий количество интернализованных NTHI с течением времени в эпителиальной кокультуре дыхательных путей. Штамм R 2 8 6 6 инокулировали в концентрации приблизительно 1 × 10⁷ CFU на вставку. Затем интернализованные бактерии собирали и подсчитывали в каждой указанной временной точке.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить длительное совместное культивирование NTHI с первичными гормональными респираторными тканями с использованием модели A PRE.