Пройдя Host-вирус Взаимодействие в Литические репликации Модель Herpesvirus

Общая цель следующего эксперимента заключается в использовании различных вирусологических и биохимических подходов для анализа роли сигнального пути хозяина в литической репликации модельного герпесвируса. В качестве примера мы изучаем роль митохондриального противовирусного сигнального белка Mavs при инфекции герпесвирусом gamma HV 68. Сначала, чтобы изучить роль Mavs при острой инфекции, мы инфицируем мышей дикого типа и мышей с нокаутом Mavs вирусом gamma HV 68 для моделирования острой вирусной инфекции.

Собирают легкие мыши и определяют вирусную нагрузку с помощью метода анализа бляшек, при котором образцы подвергают серийному разведению и высевают на чашки. Затем на монослоях подсчитывают количество бляшек. Повышенная вирусная нагрузка у мышей с нокаутом соответствующего гена свидетельствует о том, что исследуемый ген играет антивирусную роль.

Напротив, снижение вирусной нагрузки у мышей с нокаутом указывает на то, что данный ген необходим для вирусной инфекции. Для подтверждения этих результатов исследуют многоступенчатую кинетику роста вируса in vitro в эмбриональных фибробластах мыши; эмбриональные фибробласты мыши дикого типа и мыши с нокаутом mavs заражают вирусом gamma HV 68 и инкубируют в течение различного времени. Затем клетки собирают и проводят метод прижизненного подсчета бляшек для сравнения многоступенчатой кинетики роста в клетках дикого типа и клетках с дефицитом mavs.

Для дальнейшей проверки этих результатов эмбриональные фибробласты мышей дикого типа и с нокаутом mavs заражают вирусом gamma HV 68. Затем из зараженных клеток раздельно экстрагируют ДНК и РНК, после чего вирусные геномные транскрипты анализируют с помощью ПЦР в реальном времени. Идея этого протокола возникла у нас при изучении роли пути иммунного ответа хозяина в ходе литической инфекции вируса.

Данный протокол может быть применен для изучения механизмов сигнальных путей хозяина при инфицировании другими патогенами. Начните процедуру с акклиматизации мышей одного пола из одного помета в возрасте шести-восьми недель в течение четырех дней после транспортировки. Последующий эксперимент будет проводиться в помещении с уровнем биологической опасности.

В качестве подготовки наденьте средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, перчатки, маску и бахилы, работая в шкафу биологической безопасности второго уровня. Приготовьте вирусную суспензию, содержащую от 40 до 10 000 PFU gamma HV 68 и 30 µL стерильного PBS на каждую мышь, которая будет инфицирована.

Держите вирусную суспензию на льду после внутрибрюшинного введения кетамина и ксилазина. Убедитесь, что мыши находятся под седацией, проведя тест с защемлением пальца лапы. Затем с помощью пипетки по каплям введите 30 µL вирусной суспензии в левую или правую ноздрю.

Положите мышь на бок на 5–10 минут, чтобы облегчить доставку вируса в легкие через дыхательные пути. Затем поместите мышей обратно в клетку и наблюдайте за ними до полного восстановления после седации. Далее у инъецированных мышей собирают ткань легких для приготовления клеточного лизата с целью определения титра вируса на разные дни после инфицирования.

Поместите легкие, извлеченные из забитых мышей, в стерильные винтовые пробирки объемом 1.5 мл, содержащие 500 µL цирконий-силикатных шариков диаметром 1.0 мм, и रखें на льду. Если переход к следующему этапу не осуществляется в тот же день, храните образцы при температуре -80 °C.

В противном случае добавьте 1 мл холодного DMEM без сыворотки. Поместите пробирку в гомогенизатор с шариками и нажмите кнопку «пуск», чтобы гомогенизировать легкие в течение 30 секунд. Это необходимо для предотвращения перегрева образца, который может инактивировать вирус.

Охладите пробирку на льду в течение как минимум одной минуты после 30 секунд гомогенизации. Затем повторите этот процесс. Далее центрифугируйте гомогенизированную ткань при 16 000 RCF при температуре четырех градусов Цельсия в течение одной минуты.

После центрифугирования клеточный дебрис окажется на дне пробирки, а липиды — на поверхности. Немедленно возьмите супернатант, как показано здесь, для проведения анализа бляшек с использованием монослоя клеток NIH 3T3 или BHK 21. Далее проводится анализ бляшек для определения вирусного титра в образце; начните анализ бляшек с приготовления последовательных разведений вирусного супернатанта.

Сначала с помощью многоканального дозатора добавьте 270 µL среды в 96-луночный планшет. Оставьте первый ряд пустым. Затем добавьте 200 µL супернатанта в первый ряд 96-луночного планшета, используя три повторности для каждого образца.

Затем перенесите 30 µL образца из первого ряда в следующий ряд и перемешайте. Затем перенесите 30 µL смеси в следующий ряд и перемешайте. Повторяйте этот шаг несколько раз для получения десятикратных серийных разведений.

Затем добавьте разведенный вирусный супернатант на монослой клеток в 24-луночный планшет. Поместите планшет в инкубатор и встряхивайте его каждые 30 минут в течение двухчасовой инкубации. По окончании инкубации удалите супернатант из планшета, чтобы избавиться от клеточного детрита.

Затем однократно промойте клетки свежей средой. После промывки добавьте к клеткам среду, содержащую метилцеллюлозу. Инкубируйте клетки от четырех до шести дней.

Спустя четыре-шесть дней с помощью микроскопа подсчитайте количество бляшек в каждом образце. Запишите число бляшек для каждого разведения.

Затем рассчитайте среднее значение и стандартное отклонение. Лунки, содержащие слишком много или слишком мало бляшек, не могут быть использованы для точного расчета титра. Поэтому для каждого образца используйте разведение, в котором содержится от 7 до 70 бляшек.

Данный образец при разведении в 1000 раз дает в среднем 23 бляшки на лунку. Чтобы рассчитать вирусный титр в неразведенном растворе, умножьте коэффициент разведения на количество бляшек и на количество микролитров в одном миллилитре. Затем разделите полученный результат на объем разведенного супернатанта, добавленного в одну лунку.

Таким образом, в данном примере: 1000 умножить на 23 бляшки умножить на 1000 µL на мл разделить на 100 µL равно 2,3 × 10⁵ колониеобразующих единиц на мл. Далее, для определения кинетики роста gamma HV 68 в эмбриональных фибробластах мыши используется вирусный стоковый раствор с известным титром. Начинают с того, что дикий тип MEF и клетки с дефицитом определенного гена хозяина пересевают в 24-луночный планшет из расчета 10 000 клеток на лунку. На следующий день среду в каждой лунке заменяют на 0,5 мл суспензии gamma HV 68 с низкой MOI.

Поместите планшет в инкубатор при 37 °C и инкубируйте в течение двух часов. Каждые 30 минут в процессе инкубации аккуратно покачивайте планшет. С помощью пипетки удалите вирусную суспензию и добавьте к зараженным вирусом клеткам 0,5 мл свежей среды DMEM, дополненной 8% эмбриональной бычьей сыворотки.

Поместите клетки обратно в инкубатор на разные дни после заражения. Соберите клетки и среду, несколько раз пропипетируя содержимое вверх и вниз. Перенесите их в стерильные центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра и немедленно заморозьте пробирки при температуре minus 80 °C, чтобы высвободить gamma HV 68 из клеток.

Проведите три цикла замораживания и размораживания. Разморозьте клетки, поместив их при температуре 37 °C. Затем перемешайте на вортексе и снова поместите их в морозильник при температуре -80 °C.

Определите вирусный титр с помощью метода бляшек, используя монослой клеток NIH 3T3 или BHK-21, как было показано ранее, чтобы выяснить, влияет ли дефицит генов хозяина или вирусных генов на репликацию ДНК или РНК. Начните с инфицированных клеток на разные дни после заражения, удалите супернатант, промойте клетки холодным PBS и обработайте клетки трипсином на льду. Затем осадите клетки путем центрифугирования при 1000 RCF при комнатной температуре в течение одной минуты; после центрифугирования удалите супернатант и храните клетки при температуре -80 °C.

Выделите общую ДНК и РНК хозяина и вируса. Затем центрифугируйте спиновые колонки. Проведите ПЦР в реальном времени, используя общую ДНК и праймеры, специфичные для литических транскриптов вируса.

Определите относительное количество внутриклеточного генома gamma HV 68 по отношению к гену домашнего хозяйства хозяина, такому как beta actin. Синтезируйте кДНК из общей РНК с использованием олиго(dT)-праймера. Проведите ПЦР в реальном времени, используя кДНК и праймеры, указанные выше, для определения относительного количества вирусных транскриптов.

Относительно контрольного гена домашнего хозяйства хозяина, Mavs является сокращением от mitochondrial antiviral signaling, как показано здесь. Адаптерная молекула Mavs передает сигнал от цитозольных RIG-I-подобных рецепторов для активации NF-kappa B и интерферон-регулирующих факторов IRFs, которые, в свою очередь, повышают экспрессию генов провоспалительных цитокинов и интерферонов. Здесь показана вирусная нагрузка в легких мышей дикого типа и мышей из того же помета с дефицитом Mavs, инфицированных gamma HV.

Дефицит Mavs значительно снизил вирусную нагрузку в легких через 10 дней после инфицирования, что указывает на необходимость Mavs для эффективного вирусного инфицирования in vivo. На данном рисунке представлена многоступенчатая кривая роста вируса на эмбриональных фибробластах мышей дикого типа и на фибробластах с дефицитом Mavs. Заметное замедление роста вируса на эмбриональных фибробластах мышей свидетельствует о том, что Mavs необходим для эффективной вирусной репликации in vitro. Уровни мРНК вирусных литических генов в эмбриональных фибробластах мышей, инфицированных $\gamma$HV 68, были проанализированы с помощью ПЦР в реальном времени; дефицит Mavs значительно снизил уровни мРНК трех основных литических генов.

Все эти результаты в совокупности подтверждают вывод о том, что Mavs необходим для активации транскрипции gamma HV 68 и литической репликации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как исследовать взаимодействие патогена с хозяином на нескольких уровнях, как in vivo, так и in vitro. Не забывайте, что работа с патогенами может быть крайне опасной.

Во время проведения работ следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты.