Увеличение урожайности кДНК из одной ячейки в количествах мРНК в стандартных реакций обратной транскриптазы лаборатории использованием акустической Microstreaming
11 июля 2011 г.
Мы описываем новый метод для повышения кДНК выход из одноклеточных количества мРНК в противном случае стандартного лабораторного реакции обратной транскрипции. Новизна заключается в использовании micromixer, которая использует явление акустической microstreaming, смешать жидкости на микролитр масштабах более эффективно, чем тряска, вортексе или растиранием.
Данная процедура позволяет увеличить выход кДНК из количеств мРНК, соответствующих одной клетке. Начните с уравновешивания микросмесителя внутри инкубатора, настроенного на требуемую температуру реакции обратной транскрипции. Затем подготовьте стандартные лабораторные реакции ОТ, содержащие количества РНК, соответствующие одной клетке, в микролитровых объемах.
Надежно поместите реакционную пробирку в отверстия смесителя, выберите подходящие параметры перемешивания и включите микросмеситель. В конечном итоге эта процедура может быть использована для повышения выхода кДНК при проведении количественной ПЦР в качестве подготовки к реакции обратной транскрипции. Выдержите микросмеситель в инкубаторе при 37 °C в течение как минимум одного часа для уравновешивания температуры.
В стандартные стерильные безнаклеазные тонкостенные ПЦР-пробирки объемом 200 µL. Подготовьте реакции обратной транскрипции в соответствии с инструкциями поставщика, за исключением того, что используйте количество суммарной РНК, эквивалентное содержимому одной клетки. Затем подберите подходящую частоту и амплитуду микроперемешивания.
Затем надежно поместите пробирку в микросмеситель. Включите микросмеситель. Дайте реакции протекать в течение 60 минут; по завершении выключите микросмеситель и перенесите реакционные смеси на лед для немедленного использования в последующих анализах. По сравнению с другими методами, основным преимуществом микросмешивания в контексте реакций обратной транскрипции (RT) является выход кДНК.
В данном анализе методом количественной полимеразной цепной реакции кривые QPCR с использованием праймеров, разработанных для детекции кДНК, представляющей мРНК neuro one, иллюстрируют эффекты перемешивания с помощью Microm в течение первых пяти минут или всех 60 минут по сравнению с продолжительностью реакции обратной транскрипции непосредственно перед инкубацией RT. Перемешивание с помощью Microm в течение первых пяти минут не привело к значимому улучшению по сравнению с обычной процедурой. Однако перемешивание с помощью Microm на протяжении всех 60 минут обеспечило значительное увеличение выхода, эквивалентное 15 циклам QPCR.
Кроме того, анализ кривых плавления QPCR показывает, что микроперемешивание в течение всех 60 минут предшествующей реакции R two обеспечивает стабильный сигнал в дубликатных образцах, что отображено красными кривыми. Это контрастирует с вариативными кривыми, наблюдаемыми при микроперемешивании только в первые пять минут (синие кривые) или при использовании только инкубации (черные кривые); серые кривые представляют собой контроли без матрицы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен новый метод повышения выхода кДНК из мРНК одиночных клеток с использованием микросмесителя. Техника основана на использовании акустического микропотока для улучшения смешивания жидкостей в стандартных реакциях обратной транскрипции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биотехнология
- Геномика
Теоретические основы
- Синтез кДНК имеет решающее значение для анализа экспрессии генов.
- Анализ единичных клеток создает определенные трудности в отношении выхода РНК.
- Традиционные методы перемешивания могут быть недостаточными для малых объемов.
- Акустический микропоток представляет собой потенциальное решение для улучшения перемешивания.
Цель исследования
- Разработать метод увеличения выхода кДНК из мРНК одной клетки.
- Использовать микросмеситель для более эффективного перемешивания жидкостей.
- Оценить эффективность данного метода в стандартных реакциях обратной транскрипции.
Используемые методы
- Уравновешивание микромиксера в инкубаторе при 37°C.
- Подготовка стандартных реакций обратной транскрипции с РНК единичных клеток.
- Размещение реакционных пробирок в микромиксере.
- Настройка параметров перемешивания и активация микромиксера.
Основные результаты
- Наблюдалось увеличение выхода кДНК по сравнению с традиционными методами.
- Микросмеситель эффективно улучшал перемешивание в микролитровых масштабах.
- Результаты количественной ПЦР подтвердили повышение выхода.
- Метод применим для различных видов анализа РНК единичных клеток.
Выводы
- Микросмеситель обеспечивает значительное преимущество при синтезе кДНК из мРНК единичных клеток.
- Данный подход может способствовать более точному изучению экспрессии генов.
- Перспективные области применения могут включать более широкий спектр транскриптомных анализов единичных клеток.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Повышение выхода кДНК из мРНК единичных клеток устраняет критическое узкое место в процессах валидации мишеней и фенотипического скрининга. Позволяя с количественной точностью анализировать большее количество генов в каждой клетке, данный метод повышает прогностическую достоверность решений на ранних этапах поиска. Этот подход способствует снижению рисков при проверке терапевтических гипотез за счет воспроизводимых и масштабируемых молекулярных показателей, полученных из ограниченного объема биологических образцов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы за счет увеличения количества обнаруживаемых генных мишеней в одной клетке.
- Операционная ценность: снижает техническую вариабельность при конверсии мРНК в кДНК, что повышает воспроизводимость анализа между повторностями.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля препаратов за счет более надежного обнаружения малораспространенных транскриптов, связанных с механизмами заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет подготавливать валидированные библиотеки кДНК для последующего скрининга, что повышает чувствительность при поиске подходящих соединений (хитов).
- Практическая ценность: стандартизирует процесс подготовки исходной РНК с использованием доступного лабораторного оборудования, что увеличивает пропускную способность.
- Ценность для платформы: совместимость со стандартными реагентами для обратной транскрипции и аналитикой qPCR облегчает интеграцию метода в существующие каскады скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает поиск биомаркеров в редких популяциях клеток за счет улучшения пределов обнаружения транзиторных или низкоэкспрессируемых мишеней.
- Практическая ценность: предоставляет количественные, воспроизводимые результаты, которые способствуют межфункциональному согласованию между группами по поиску мишеней и доклиническими исследованиями.
- Снижение рисков: снижает риск ложноотрицательных результатов при валидации мишеней за счет увеличения выхода кДНК без необходимости в специализированной микрофлюидной инфраструктуре.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум ранних этапов поиска лекарственных средств, в частности, поддерживая переход от генерации гипотез о мишенях к идентификации соединений-лидеров за счет повышения качества и количества молекулярных соединений для функционального скрининга.
- Открывочная биология: Улучшает валидацию мишеней, обеспечивая комплексное транскрипционное профилирование из количеств мРНК, соответствующих одной клетке.
- Скрининг: Повышает готовность анализа за счет увеличения выхода кДНК, что позволяет надежно регистрировать изменения экспрессии, индуцированные соединениями.
- Аналитика: Создает количественные результаты, совместимые с qPCR, что позволяет проводить статистическое сравнение экспрессии генов в различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклинической работой за счет возможности обнаружения значимых для заболевания транскриптов в ограниченных образцах первичных клеток.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой масштабируемую и недорогую технологию, применимую в многочисленных проектах и модельных системах, не требующую специализированных микрофлюидных платформ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при валидации мишеней за счет снижения технического шума при синтезе кДНК из ограниченного количества исходной РНК.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов по анализу экспрессии генов на уровне отдельных клеток с использованием стандартного лабораторного оборудования.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки («go/no-go») за счет обеспечения более комплексного молекулярного профилирования каждого образца, что снижает число биологических ложноотрицательных результатов.
- Влияние на портфель: Поддерживает продвижение проектов с учетом рисков, повышая уверенность в данных о взаимодействии с мишенью и модуляции сигнальных путей, полученных в результате анализа отдельных клеток.
Особенности реализации
- Требуется знание принципов акустического микропотока и умение оптимизировать параметры частоты и амплитуды для конкретных объемов реакционной смеси.
- Необходим доступ к инкубатору с регулируемой температурой и совместимым тонкостенным PCR-пробиркам для эффективного формирования мениска.
- Требуется стандартизация продолжительности перемешивания и настроек мощности для всех пользователей с целью обеспечения воспроизводимого выхода кДНК.
- Предполагает проверку целостности нуклеиновых кислот после перемешивания для подтверждения отсутствия деградации вследствие механического или термического воздействия.
- Применимо только в тех случаях, когда увеличение выхода кДНК напрямую повышает чувствительность последующего анализа, такого как qPCR или подготовка библиотек для секвенирования.
