Создание Переходные поры клеточной мембраны с помощью стандартных струйных принтеров

Общая цель данной процедуры заключается в создании временных пор в клеточных мембранах с помощью струйной печати. Это достигается путем предварительной модификации стандартного струйного принтера. На втором этапе осуществляется опорожнение и очистка стандартного картриджа для чернил, чтобы обеспечить возможность заливки биочернил.

Затем исследуемые клетки суспендируют в растворе флуоресцентно меченных мономеров актина и PBS для приготовления раствора биочернил. Заключительным этапом является печать биочернил на предметных стеклах с использованием модифицированного принтера и картриджа. В конечном итоге с помощью флуоресцентной микроскопии можно показать, что конъюгированные с Fluor 4 мономеры G-актина были интернализованы напечатанными клетками через временные мембранные поры.

Основным преимуществом данного метода по сравнению со стандартной трансфекцией и микроинъекцией в клетки является простота использования этой техники печати и высокая жизнеспособность клеток. Хотя этот метод может дать представление о генетике, его также можно применять в других областях исследований, таких как биофизика клетки и тканевая инженерия в биофизике клетки. Данный метод позволяет с легкостью наблюдать за цитоскелетом клетки в процессе ее миграции.

Идея этого метода возникла у нас, когда мы захотели визуализировать изменения в организации цитоскелета под воздействием приложенных к клеткам сил. Сначала отсоедините пластиковые зажимы от нижнего основания принтера, а затем медленно поднимите верхний пластиковый корпус. После этого отсоедините панель подсветки дисплея кнопок от верхней части принтера, оставив её подключенной к материнской плате принтера.

Используя салфетки Kim wipes и этанол, очистите внутреннюю часть принтера, особенно области, где располагается картридж с чернилами и где происходит печать. Затем найдите кабель питания механизмов подачи бумаги для HP desk Jet 500.

Они расположены чуть ниже лотка для бумаги слева спереди; отсоедините кабели от материнской платы. Теперь найдите механизм обнаружения бумаги и закрепите проволочную петлю на сером пластиковом рычаге, расположенном над механизмом подачи бумаги и позади него, чтобы она служила ручной ручкой, и установите здесь платформу. Пенопластовый транспортировочный держатель для 15 центрифужных пробирок используется вместе с несколькими предметными стеклами микроскопа, зафиксированными скотчем в области печати перед механизмом подачи бумаги, чтобы поднять необходимые стекла для печати на уровень чуть ниже печатающей головки картриджа.

Наконец, для соблюдения правил асептики поместите принтер в ламинарный бокс. Начните с извлечения картриджа из упаковки, оставив защитную ленту на контактах принтера и печатающей головке. Зафиксируйте корпус картриджа зажимом, чтобы зеленая верхняя часть оставалась свободной от каких-либо препятствий, и используйте ручной роторный режущий инструмент.

Отрежьте зеленую верхнюю часть картриджа, удалите все остатки чернил из резервуара, а затем снимите защитную пластиковую ленту, закрывающую контакты принтера и печатающую головку. В процессе выполнения этих действий из печатающей головки, скорее всего, будет вытекать вода, что не нанесет вреда картриджу. Когда вода станет прозрачной, дайте картриджу высохнуть.

Для обеспечения чистоты среды печати сначала полностью погрузите картридж в стакан с деионизированной водой, затем подвергните его воздействию ультразвука в течение 15 минут. После ультразвуковой обработки извлеките картридж и стряхните излишки воды. Распылите 70% ethanol в картридж для создания более асептических условий.

После сбора интересующих клеток центрифугируйте их в пяти миллилитрах свежей среды в конической центрифужной пробирке объемом 15 миллилитров в течение пяти минут при 250 ×g при комнатной температуре. Затем аспирируйте среду и ресуспендируйте клетки в свежеприготовленном стоковом растворе флуоресцентного G-актина до концентрации 1 × 10⁵ клеток на миллилитр. При создании биочернил следует учесть, что 250 µL биочернил достаточно для печати на трех покровных стеклах с показанным здесь линейным паттерном. После включения и прогрева принтера поместите выбранную поверхность для печати в данное место; в центре предварительно собранного предметного столика используются покровные стекла размером 22 мм на 22 мм.

Затем откройте программу для рисования и выберите нужный шаблон. Теперь перенесите пипеткой примерно 100–120 µL клеточной суспензии в небольшое круглое отверстие в нижней части картриджного отсека. Распечатайте файл; пока принтер снова прогревается, картридж переместится в рабочее положение.

Когда картридж немного смещается влево относительно приемника капель чернил и замирает в этом положении, потяните вверх за механизм подачи бумаги, и начнется процесс печати. Принтер HP DeskJet 500 будет печатать на покровном стекле, помещенном в центр печатного стола, используя биочернила, представляющие собой суспензию фибробластов в растворе мономера G-актина.

С помощью принтера серии HP 26 клетки из чернильного картриджа были нанесены на стеклянные покровные стекла микроскопа. На данном рисунке представлен типичный результат печати фибробластов, в которых incorporating-инкорпорированы флуоресцентные мономеры актина. Эта схема использовалась на предыдущем рисунке для создания непрерывной линии печатного раствора на большей части предметного стекла микроскопа.

На данном рисунке показана прямая линия, вдоль которой были взаимно нанесены биочернила и клетки. Обратите внимание, что сразу после печати наблюдается усиление фоновой флуоресценции, так как раствор биочернил, в котором суспендированы клетки, содержит свободные избыточные флуоресцентные мономеры актина; инкубация клеток в течение примерно 10 минут после печати способствует их адгезии к предметному стеклу, что позволяет вымыть избыточный раствор мономера с подложки свежей ростовой средой, значительно снижая фоновую флуоресценцию. Здесь представлено репрезентативное изображение трех фибробластов 3T3, напечатанных в локализованной зоне печати; на этой флуоресцентной микрофотографии клетки, сделанной через 15 минут после печати, показан G-актин зеленым цветом, ядро синим, а также совмещенное изображение G-актина и ядерного красителя.

На следующих двух изображениях представлена флуоресцентная микроскопия двух фибробластов, расположенных в линию, через три часа после печати. На первом изображении видны флуоресцентно меченные мономеры актина внутри клеток. Второе изображение представляет собой наложение флуоресцентного канала на фоновое изображение, которое демонстрирует, что, несмотря на наличие некоторых частиц мусора на предметном стекле в левом нижнем углу, они не флуоресцируют.

Наконец, здесь представлена контрольная группа непечатных клеток, которые инкубировались в течение трех часов с флуоресцентно мечеными мономерами, чтобы продемонстрировать, что мономеры не могут проникнуть через клеточную мембрану без ее пермеабилизации посредством печати клеток. При выполнении этой процедуры важно иметь несколько очищенных и готовых к использованию картриджей, так как засорение принтера является одной из проблем, замедляющих выполнение данного метода. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как переоборудовать стандартный настольный принтер для печати живых клеток, что способствует созданию переходной силы воздействия на мембрану.