Клеточная Кальций Пробирной для средних и высокопроизводительного скрининга из ГТО Функции канала с помощью FlexStation 3

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать применение системы Flex Station 3 для изучения фармакологического профиля канала потенциал-зависимого рецептора транзиторного типа TRPA1. Для этого сначала подготавливают клетки, экспрессирующие каналы TRPA1, в 96-луночных микротитровальных планшетах.

После промывки клеток в автоматическом промывателе микропланшетов клетки насыщают кальций-чувствительным флуоресцентным красителем Fluo-4. После периода загрузки красителя в клетки следует несколько дополнительных промывок. Следующим этапом процедуры является подготовка планшета с соединениями, включая TRPA1-агонист и предполагаемый TRPA1-антагонист.

В качестве заключительного этапа настраиваются параметры программного обеспечения для считывания планшета в системе Flex Station three. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие зависимости «доза — ответ» для активации TRPA1 флуфеномиковой кислотой и ингибирования соединением-антагонистом A. Хотя данный метод позволяет изучить механизмы активации TRPA1 путем измерения притока ионов кальция, его также можно применять для изучения функций других проницаемых для кальция ионных каналов и G-белок-сопряженных рецепторов с использованием кальций-чувствительных флуоресцентных красителей или красителей мембранного потенциала.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как кальциевый имиджинг и ручной патч-клемпинг, является то, что этот трудосберегающий метод обеспечивает высокопроизводительный скрининг функций и модуляции кальциевых каналов, железопроницаемых каналов и других рецепторов, мобилизующих Ca. Перед началом данного протокола вырастите клетки HEK 293, стабильно трансфектированные Trip A1, до плотности 70–90%, как описано в письменном протоколе. Чтобы начать подготовку клеток для анализа содержания кальция, покройте 96-луночные планшеты, внеся пипеткой 50 µL поли-L-орнитина в каждую лунку; инкубируйте планшеты при 37 °C не менее 15 минут.

После инкубации один раз промойте клетки фосфатно-солевым буфером KO. После обработки трипсином перенесите необходимое количество клеток HEC 2 93 в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте образец. Удалите супернатант и ресуспендируйте полученный осадок клеток.

В культуральную среду DMEM, дополненную 10% термоинактивированной сывороткой плода говяжьего, внесите по 100 µL клеточной суспензии в каждую лунку планшета на 96 лунок. Используя многоканальный дозатор, оставьте планшет в вытяжном шкафу минимум на 30 минут, после чего поместите его в увлажненный инкубатор для культур клеток на период от 20 до 44 часов. Для подготовки к анализу на содержание кальция сначала приготовьте растворы согласно письменному протоколу.

После приготовления смешайте 10 µL 1 mM Fluo-4 с 10 µL ONIC.F1 27, затем перенесите все содержимое в 5 mL буфера для анализа Fluo-4, дополненного 0,1% бычьего сывороточного альбумина.

Затем промойте клетки, выращенные в 96-луночных планшетах, раствором HBSS по 80 µL на лунку дважды, используя мойку для микропланшетов. После промывки добавьте с помощью многоканального дозатора раствор для загрузки Fluo-4 AM по 50 µL на лунку и инкубируйте планшет при 37 °C в течение одного часа. В течение этого часа загрузки клеток подготовьте серию 3X растворов агонистов, серию 3X растворов антагониста и большой объем 300 µM агониста в буфере для анализа Fluo-4.

Перенесите по 300 µL разведенных растворов соединений в 96-луночный планшет для соединений. По возможности расположите серийные разведения соединения, а также соответствующие положительный и отрицательный контроли в одном столбце планшета. Поскольку станция Flex reads считывает по одному столбцу за раз, в качестве заключительного этапа подготовки клеток добавьте по 300 µL 300 µM раствора агониста в лунки, соседние с каждой лункой, содержащей антагонист.

Трижды промойте загруженные клетки буфером FluO-4 acid с помощью мойки микропланшетов, оставив после последнего цикла промывки 80 µL буфера FluO-4 acid в каждой лунке. Для начала считывания планшета включите систему FlexStation 3 и запустите программное обеспечение SoftMax Pro 5.2.

Сохраните эксперимент под новым именем файла в настройках. Выберите гибкий режим (flex mode) и введите параметры для измерения эффектов агониста и антагониста, как указано в письменной процедуре. Затем установите новый блок с наконечниками, планшет с соединениями и планшет для считывания в соответствующие лотки станции flex station. Три.

Начните считывание планшета, нажав кнопку read в программном обеспечении Soft Max Pro. Система Flex Station three будет считывать по одному столбцу за раз и добавлять соединения в заранее запрограммированные моменты времени, не прерывая процесс считывания. После завершения запуска экспериментальные данные можно обработать непосредственно с помощью программного обеспечения Soft Max PRO или скопировать и вставить в любую программу для работы с электронными таблицами, такую как Microsoft Excel.

Для анализа данных постройте кривые «концентрация-ответ» для трипаносомального агониста флуфонемиковой кислоты и для предполагаемого трипаносомального агониста-антагониста соединения А, используя метод наименьших квадратов, как описано в письменной процедуре. TRPA1 представляет собой проницаемый для кальция катионный канал, активация которого приводит к притоку кальция, который можно обнаружить с помощью кальций-чувствительного красителя Fluo-4 AM. Репрезентативные кривые временного хода изменений флуоресценции в ответ на серию концентраций флуфонемиковой кислоты или FFA показаны для более высоких концентраций. FFA вызывала увеличение флуоресценции с гораздо более быстрой кинетикой, чем при низких концентрациях, несмотря на схожие уровни пиковой флуоресценции.

Чтобы выявить эти различия, была построена кривая зависимости отклика от концентрации путем измерения начальных скоростей увеличения флуоресценции. При добавлении различных концентраций FFA полумаксимальная эффективная концентрация FFA составила 55,4 micromolar. Также представлена кривая зависимости отклика от концентрации при ингибировании вызванного FFA кальциевого отклика предполагаемым антагонистом TRPA1 — соединением A.

Доза независимо снижала ответ клеток trip A one на FFA с полумаксимальной ингибирующей концентрацией 4,3 micromolar. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое понимание того, как изучать фармакологические профили triple A one и родственных каналов с использованием flag station three.