Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных
23 августа 2012 г.
Мы представляем микрофлюидных подход к экспрессии белка массивов. Устройство состоит из тысяч реакционных камерах контролируется микро-механических клапанов. Микрофлюидных устройство соединяется с микрочипов печатных библиотеки генов. Эти гены затем расшифрованы и переведены на-чипе, в результате чего белок массива готово для экспериментального использования.
Общая цель данной процедуры заключается в создании модульного белкового массива, не требующего стадии очистки, что делает его совместимым с любой библиотекой белков. Это достигается путем предварительного синтеза генов с помощью сборки методом ПЦР. Затем синтетические гены наносятся в виде массива на эпоксидные предметные стекла.
Для изготовления микрофлюидного устройства используйте PDMS с силиконовыми формами для контроля и потока. Затем микрофлюидное устройство совмещают с массивом нанесенной ДНК. В завершение в микрофлюидное устройство подают лизат ретикулоцитов кролика для экспрессии белков.
В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие экспрессию тысяч белков с помощью флуоресцентного антительного мечения. Использование метода на основе микрофлюидики имеет несколько преимуществ по сравнению с существующими методами, такими как белковые микрочипы. Мы создаем микрочипы из ДНК, а затем используем клеточные экстракты для синтеза белков непосредственно на устройстве.
Таким образом, очистка белков не требуется, и они никогда не высыхают, оставаясь свежими на протяжении всего эксперимента. Микрофлюидный метод также обеспечивает более высокую чувствительность. Для изготовления микрофлюидного устройства подвергните формы для управления и потока из силикона воздействию паров хлортриметилсилана в течение 10 минут для облегчения отделения эластомера.
После этапов запекания приготовьте смесь эластомера на основе силикона и отвердителя в двух различных соотношениях: пять к одному и 20 к одному для контрольных форм и форм с каналами соответственно. Залейте PDMS в соотношении пять к одному на контрольный слой. Удалите пузырьки воздуха из контрольного слоя и запекайте его в течение 30 минут при 80 °C.
Затем нанесите смесь PDMS в соотношении 20:1 на слой потока методом центрифугирования при 2 600 RPM в течение 60 секунд, после чего подвергните термической обработке при 80 °C в течение 30 минут. Медленно отделите управляющий слой от формы, стараясь не повредить структуру из SU-8. Затем с помощью скальпеля вырежьте устройство по периметру и под микроскопом с помощью тупой иглы проделайте отверстия для доступа к управляющим каналам.
Выполните ручное совмещение слоев потока и управления, начиная с верхнего левого угла, и расположите кнопковый клапан слоя управления по центру реакционной камеры. Затем совместите первый ряд и осторожно опустите слой управления ряд за рядом. Убедитесь, что все кнопковые клапаны находятся по центру реакционных камер, а адресные и входные клапаны пересекают потоковые каналы в правильных позициях.
Повторяйте этот процесс локально до тех пор, пока все ряды не будут выровнены. После полного выравнивания снимите любое натяжение ПДМС, осторожно приподняв его за края и углы. Затем подвергните устройство термической обработке при температуре 80 °C в течение двух часов.
Обрежьте устройство по периметру и отделите двухслойный слой от отверстий вырубки формы потока, чтобы получить доступ к проточным каналам для создания ДНК-конструкций для устройства. Проведите ПЦР для синтеза генов, состоящих из промотора T7, сайта связывания рибосом, открытой рамки считывания с различными эпитопными метками на обоих концах и терминатора T7. Для подготовки синтетических генов к массированию приготовьте смесь полиэтиленгликоля и D-триозы дигидрата. Раздайте по 2 µL на реакцию в лунки планшета на 384 лунки.
Планшет для микротитрования. Добавьте синтетические гены в 384-луночный планшет. Затем добавьте дистиллированную воду до конечного объема 20 µL.
Затем с помощью микроматричного споттера нанесите серию синтетических генов на стеклянные подложки с эпоксидным покрытием. Под стереомикроскопом вручную совместите микрофлюидное устройство с матрицей генов так, чтобы пятно ДНК находилось в центре камер для ДНК. Затем выровняйте остальные ряды.
Завершите процесс точной настройкой всего устройства, чтобы снять любые напряжения в PDMS и обеспечить его надежное прикрепление к микромассиву. Локально приподнимите его. В завершение приклейте устройство к стеклянному предметному стеклу, инкубируя его в течение ночи на нагревательном столе при 80 °C.
Пищевые красители в данном разделе используются для визуализации. Клапаны в управляющем слое приводятся в действие с компьютера с помощью LabVIEW. Скрипт LabVIEW управляет серией электромагнитного микроклапанов через электронный блок управления.
Манифольд электромагнитных клапанов подключен к источнику сжатого воздуха, который регулирует поток и давление воздуха в управляющих клапанах устройства. Используя гибкую пластиковую трубку с внутренним диаметром 0,02 inches и штифт из нержавеющей стали, подключите устройство к манифольду электромагнитных клапанов. Заполните трубки дважды дистиллированной водой и вставьте штифт в технологические отверстия управляющего слоя.
Убедитесь, что каждая пробирка подключена к соответствующему управляющему каналу. Чтобы активировать управляющие каналы, запустите приложение LabVIEW, установите давление воздуха на 5 PSI, затем подайте давление воздуха, активировав клапан с помощью скрипта LabVIEW. Это позволит направить воду в управляющие каналы из PDMS для выявления возможных перекрестных помех между управляющими каналами в дефектных устройствах.
Сначала заполните сэндвич и адресные клапаны. После того как все управляющие каналы и клапаны будут заполнены водой, активируйте клапаны, чтобы перекрыть потоковые каналы под ними. Для этого сначала увеличьте давление воздуха до 15 PSI, затем воспользуйтесь программой LabVIEW, используя набор переключателей «вкл/выкл», подключенных к отдельным электромагнитным клапанам.
Активируйте все клапаны, нажав на все кнопки переключателей, чтобы убедиться, что все клапаны открыты. Подсоедините трубку к одному из входов потока и подайте в устройство воздух под давлением 4–5 PSI. Это позволит освободить любые прилипшие клапаны от предметного стекла.
Устройство теперь подготовлено и готово к визуализации. Для визуализации реагентов в данном разделе используется желтый пищевой краситель, а бесцветный раствор представляет собой «хиппи» (hippies). Чтобы способствовать самосборке белкового массива на поверхности и предотвратить неспецифическую адсорбцию внутри микрофлюидного устройства, химически модифицируйте поверхность, сначала подключив новую трубку с необходимым раствором к одному из проточных каналов устройства. Затем подключите свободный конец трубки к ручному коллектору и откройте подачу воздуха под давлением.
Перенесите 40 µL биотинилированного BSA в новую пробирку и пропускайте примерно половину этого объема через устройство в течение 20 минут. Используйте 50 mM HEPES для промывки от любого нереагирующего субстрата между каждым из этапов. Затем пропускайте 25 µL стрептавидина в течение 20 минут.
После нанесения биотинилированного BSA промойте систему раствором HEPES в течение пяти минут, чтобы очистить поверхность вокруг кнопки; закройте клапан кнопки, пропустите оставшуюся часть биотинилированного BSA, а затем снова промойте раствором HEPES в течение пяти минут. Наконец, чтобы создать массив анти-His-тегов под кнопкой, откройте клапан кнопки и в течение 20 минут пропускайте 30 µL Penta-His-биотина для формирования массива белков на устройстве. Откройте шейные клапаны и введите ретикулоциты кролика.
Быстро введите раствор для реакции сопряженной транскрипции и трансляции через устройство в камеру с ДНК. Затем закройте зажимные клапаны, чтобы изолировать каждый ген от внешней среды, и инкубируйте устройство на нагревательной плитке в течение 2,5 часов при 30 °C. После этого пометьте С-концевой терминальный участок белков антителом C mix SI three.
Наконец, используя сканер микромассивов с лазером 532 нм и эмиссионным фильтром 575 нм, определите уровни белков. На данном рисунке показаны различные уровни экспрессии белков на белковом массиве.
Обычно около 20% генов из библиотеки не экспрессируются до детектируемого уровня. Фоновые уровни определяли с помощью камер, на которые не наносили ДНК. Таким образом, сигналы из соответствующих камер с белками обусловлены либо шумом, либо неспецифической адсорбцией меченых антител.
При правильном выполнении проверка устройства занимает четыре часа, а эксперимент с чипом — пять часов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен микрофлюидный подход для экспрессии белковых массивов с использованием устройства с тысячами реакционных камер, управляемых микромеханическими клапанами. Интеграция библиотеки генов, нанесенной методом микрочипирования, позволяет осуществлять транскрипцию и трансляцию непосредственно на чипе, что приводит к получению готового к использованию белкового массива.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микрофлюидика
- Экспрессия белков
- Генные библиотеки
Теоретические основы
- Белковые микрочипы имеют важное значение для различных биологических анализов.
- Традиционные методы часто требуют стадий очистки, что ограничивает их совместимость.
- Микрофлюидные устройства позволяют оптимизировать процесс экспрессии белков.
- Сборочная ПЦР используется для создания синтетических генов с целью их размещения на чипе.
Цель исследования
- Создание модульного белкового массива без этапов очистки.
- Повышение совместимости с любой библиотекой белков.
- Повышение эффективности экспрессии белков с использованием микрофлюидики.
Используемые методы
- Генерация синтетических генов с помощью сборки методом ПЦР.
- Размещение синтетических генов в виде массивов на эпоксидных предметных стеклах.
- Изготовление микрофлюидного устройства с использованием PDMS.
- Подача лизата ретикулоцитов кролика в устройство для экспрессии белков.
Основные результаты
- Было успешно создано функциональное микрофлюидное устройство.
- Белки экспрессировались непосредственно на чипе без предварительной очистки.
- Метод продемонстрировал совместимость с различными библиотеками белков.
- Были эффективно осуществлены транскрипция и трансляция на чипе.
Выводы
- Данный микрофлюидный подход упрощает создание белковых микрочипов.
- Он устраняет необходимость в очистке, что повышает удобство использования.
- Этот метод может быть применен к различным библиотекам белков для проведения исследований.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данная микрофлюидная платформа для экспрессии белков обеспечивает высокопроизводительное создание массивов функциональных белков без необходимости их очистки, что устраняет одно из основных препятствий при валидации мишеней и скрининге взаимодействий. Благодаря поддержанию белков на чипе в нативном, неденитурированном состоянии, данный метод позволяет надежно регистрировать белок-белковые, белок-ДНК и белок-РНК взаимодействия. Эта возможность повышает достоверность прогнозов на ранних этапах поиска за счет снижения количества ложноотрицательных результатов, вызванных потерей белка или его неправильным фолдингом в процессе очистки.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем экспрессии полноразмерных белков с правильным фолдингом и посттрансляционными модификациями.
- Операционная ценность: исключает этапы очистки, что снижает потери образцов и увеличивает пропускную способность при крупномасштабном скрининге библиотек.
- Прогностическая ценность: способствует снижению механистических рисков, предоставляя количественные данные об экспрессии тысяч вариантов параллельно.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет создавать стандартизированные белковые массивы непосредственно из ДНК-матриц, обеспечивая воспроизводимость от серии к серии для проведения повторяемых анализов взаимодействий.
- Практическая ценность: объединяет массирование генов и экспрессию белков на одном микрофлюидном устройстве, сводя к минимуму время ручного труда и риск перекрестного загрязнения.
- Готовность к анализу: обеспечивает получение количественных флуоресцентных сигналов, совместимых со сканерами микрочипов для высокоплотного картирования взаимодействий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает быстрое профилирование белковых взаимодействий по мишеням, имеющим значение для заболевания и выявленным в ходе предварительных омиксных исследований.
- Соответствие биомаркерам: позволяет проводить скрининг аутоантител или событий терапевтического связывания с использованием образцов, полученных от пациентов, на массивах экспрессированных антигенов.
- Снижение доклинических рисков: позволяет на ранних этапах оценить профили нецелевого связывания или перекрестной реактивности перед дальнейшим продвижением кандидатов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум открытий — от подготовки синтетических библиотек генов до скрининга взаимодействий, обеспечивая плавный переход от идентификации мишени к валидации ведущих соединений.
- Открытие в биологии: Обеспечивает проверку гипотез путем экспрессии массивов генов для оценки функциональной активности белков без искажений, связанных с очисткой.
- Скрининг: Позволяет получать стандартизированные массивы свежих белков, готовых к немедленному использованию в биохимических или биофизических анализах взаимодействия.
- Аналитика: Обеспечивает количественные результаты на основе флуоресценции, что позволяет сравнивать уровни экспрессии и аффинность связывания в тысячах различных условий.
- Трансляционные исследования: Связывают генетические варианты с функциональными белками, обеспечивая корреляцию с фенотипическими или клиническими данными.
- Корпоративное повторное использование: Микрофлюидная платформа может быть перепрограммирована с использованием новых массивов ДНК, что поддерживает проведение итерационных кампаний по скринингу в рамках нескольких проектов.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишеней за счет экспрессии белков в нативном состоянии, что снижает количество артефактов, возникающих при очистке или денатурации.
- Операционная ценность: Обеспечивает параллельную обработку тысяч реакций на компактной площади, повышая эффективность использования реагентов и общую пропускную способность.
- Стратегическая ценность: Ускоряет принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет оперативного получения данных о взаимодействиях для больших библиотек вариантов.
- Влияние на портфель: Облегчает приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе комплексных профилей взаимодействия и точности экспрессии.
Особенности реализации
- Требуется опыт в изготовлении микрофлюидных устройств, включая формование из PDMS и совмещение слоев.
- Зависит от наличия оборудования для нанесения микрочипов с целью создания ДНК-матриц и систем микрофлюидного управления (например, LabVIEW с электромагнитными клапанами).
- Необходимы стандартизированные протоколы подготовки генных библиотек, включая сборку с помощью ПЦР и эпитопное мечение для детекции.
- Подразумевает оптимизацию времени инкубации и концентраций реагентов (например, лизата ретикулоцитов кролика, биотинилированных реагентов) для достижения конкретных целей по экспрессии белков.
- Ограничено доступностью мощностей по изготовлению микрофлюидных устройств и уровнем технического мастерства, необходимым для точного совмещения и склеивания слоев.
