Криоконсервация эмбрионов мыши на этиленгликоля основе Витрификация

Общая цель данной процедуры заключается в криоконсервации эмбрионов мыши в жидком азоте и их последующем размораживании для получения живых мышей. Для этого эмбрионы мыши сначала погружают в среду для эквилибрации, затем переносят в среду для витрификации в криопробирке, после чего помещают в резервуар с жидким азотом. Впоследствии эмбрионы размораживают в среде с высокой осмолярностью и инкубируют в культуральной среде до их переноса в реципиентных самок.

В конечном итоге результаты показывают выживаемость более 90% эмбрионов после размораживания витрифицированных образцов, а показатели рождаемости после переноса эмбрионов составляют от 30 до 70%. Основным преимуществом данной методики является то, что проникающий криопротектор гликоль менее токсичен для эмбрионов, чем традиционные криопротекторы. Перед началом выполнения данного протокола процедуру продемонстрирует технический специалист из моей лаборатории.

Поместите два эмбриона мыши на стадии двух клеток, полученных путем естественного спаривания или стандартными методами ИФВ, в криопробирку для последующего хранения, добавив 50 µL раствора для замораживания эмбрионов EF S 40. Затем подготовьте пластическую чашку Петри диаметром 35 мм или 60 мм, налив в нее 50 µL раствора EFS 20 комнатной температуры.

С помощью стеклянного капилляра перенесите до 30 эмбрионов в чашку. Будьте осторожны, чтобы не перенести культурную среду. Также, чтобы предотвратить дегидратацию эмбрионов, поместите их на дно капли.

Примерно через 60–90 секунд с помощью капиллярной трубки отберите дегидратированные эмбрионы, имеющие сморщенную морфологию. Перенесите эти эмбрионы в раствор EFS в криопробирке, стараясь перенести как можно меньше раствора EFS 20.

После переноса эмбрионов дайте им осесть в EFS 40 в течение одной минуты перед их замораживанием в жидком азоте. Перед размораживанием эмбрионов поместите в чашку для культивирования не менее двух капель по 10 µL среды для культивирования эмбрионов с высокой осмолярностью, например, среды M 16. Затем полностью закройте капли силиконовым или минеральным маслом и поместите чашку в инкубатор с углекислым газом до начала использования.

Затем, используя защитную маску и криоперчатки, нагрейте раствор TS one до 37 °C. Извлеките эмбрионы из резервуара с жидким азотом. Теперь быстро откройте криопробирку и слейте жидкий азот обратно в резервуар или в подходящий контейнер.

Затем подождите 30 секунд. Теперь добавьте в криопробирку 850 µL подогретого раствора TS one. Осторожно аспирируйте и вытесните раствор примерно 10 раз для его равномерного растворения.

Затем перенесите весь объем в пластическую чашку Петри диаметром 60 мм или на предметное стекло; подождите три минуты, чтобы эмбрионы уравновесили свою температуру с комнатной, при которой они должны находиться до конца процедуры. Не используйте нагревательные устройства.

Быстро осмотрите эмбрионы в чашке под стереомикроскопом, чтобы зафиксировать их внешний вид в начале данной инкубации. Примерно через две минуты инкубации погрузите эмбрионы, осторожно встряхнув чашку до тех пор, пока среда не распределится по всей ее поверхности. В последнюю минуту инкубации нанесите в чашку три отдельные капли раствора TS two объемом 50 µL каждая.

По истечении трех минут с помощью стереомикроскопа убедитесь, что эмбрионы слегка сжались. Если эмбрионы все еще остаются набухшими, продолжайте инкубацию еще от одной до трех минут. Теперь перенесите эмбрионы с помощью стеклянного капилляра в первую каплю раствора TS two.

Подождите три минуты и перенесите эмбрионы во вторую каплю. Затем — в третью каплю. В завершение извлеките из инкубатора чашку с подготовленной средой для эмбрионов и с помощью стеклянного капилляра перенесите эмбрионы в первую каплю среды.

При осмотре под стереомикроскопом эмбрионы должны постепенно восстановить свою нормальную морфологию. Теперь верните чашку в инкубатор примерно на 10 минут. Затем промойте образец, чтобы удалить остатки сахарозы, перенесенные из второго этапа TS.

Перенесите эмбрионы в следующую каплю культуральной среды. Продолжайте культивирование эмбрионов в CO2-инкубаторе до их переноса в uc реципиентных самок. После витрификации и восстановления от 300 до 480 эмбрионов трех различных линий мышей выживаемость была очень высокой.

После размораживания доля эмбрионов с нормальной морфологией составила от 93 до 99%, и как минимум 84% из этих эмбрионов развились в бластоцисты. Не забывайте, что работа с жидким азотом может быть крайне опасной; необходимо соблюдать меры предосторожности, чтобы избежать прямого контакта и свести к минимуму воздействие при нахождении на близком расстоянии от утечки. При работе с азотом всегда следует придерживаться данной процедуры.