Создание двумерных рисунком Подложки для конфайнмента белков и клеточных

Общая цель следующего эксперимента заключается в разработке двумерно структурированной подложки для контроля абсорбции белков и роста клеток. Это достигается путем использования фотолитографии для изготовления структурированной мастер-формы, которая затем применяется для создания штампа из A-P-D-M-S для микроконтактной печати. На втором этапе подготавливается структурированная золотая подложка, что включает в себя микроконтактную печать для создания паттерна с областями, которые абсорбируют белок или препятствуют его осаждению.

Затем на подложку наносят белок и клетки для визуализации и изучения паттерна. Результаты клеточного роста и поведения, полученные с помощью флуоресцентной и фазово-контрастной микроскопии, демонстрируют эффективное ограничение белков и клеток в пределах паттернов на данных подложках. Основным преимуществом этого метода по сравнению с другими существующими способами, такими как печать белков MicroCon, является то, что монослой с гликолевыми терминальными группами предотвращает неспецифическую адсорбцию белков и клеток на фоновых участках паттерна.

Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку технику штамповки необходимо оптимизировать для каждого конкретного печатаемого паттерна. Чтобы начать подготовку центрирующего мастер-шаблона с паттерном, поместите кремниевую пластину на центрифугу для нанесения покрытий (спин-котер) и на первом этапе двухцикловой программы центрифугирования промойте пластину ацетоном. На втором этапе программы ацетон испарится, в результате чего в начале цикла получится чистая сухая пластина; нанесите на пластину фоторезист, а затем выполните центрифугирование при условиях, описанных ранее.

Проведите мягкий нагрев (soft bake) подложки, покрытой фоторезистом, при 110 °C в течение двух минут на горячей плите с высокой равномерностью нагрева. Затем выполните фотолитографию подложки, покрытой фоторезистом, используя установку для совмещения маски и соответствующую маску.

Сначала поместите подложку на вакуумный стол установщика масок. Затем вставьте маску в лоток держателя и включите вакуум для фиксации маски, чтобы обеспечить плотный контакт между маской и подложкой. Поднимайте подложку до ее соприкосновения с маской.

Используйте оптику установки для совмещения, чтобы подтвердить плотность контакта. В завершение включите лампу, чтобы подвергнуть подложку воздействию УФ-излучения через литографическую маску. Проявите структурированную пластину в проявителе в течение 1 минуты 45 секунд при осторожном перемешивании.

Тщательно промойте деионизированной водой полупроводниковой степени очистки и высушите струей газообразного азота; проверьте качество проявления рисунка с помощью микроскопа с УФ-фильтром. Начните выполнение данной процедуры с приготовления смеси смолы и отвердителя в массовом соотношении 10:1. Перемешайте cigar 180 2 до полной однородности.

Покройте фотолитографическую подложку смесью в одноразовой чашке Петри в вакуумном эксикаторе; удаляйте воздух из PDMS, покрывающего мастер-форму, до полного исчезновения пузырьков. Убедившись, что мастер-форма находится на дне чашки, оставьте штамп для отверждения в печи при температуре 65 °C на 1,5 часа. После отверждения PDMS-штампа аккуратно отделите его от мастер-формы и обрежьте до нужного размера.

Храните штамп в закрытом контейнере рабочей стороной вверх для защиты от пыли и загрязнений. Для подготовки подложек к осаждению металла сначала обработайте круглые стеклянные покровные стекла кислородной плазмой в течение 10 минут. Затем дважды промойте покровные стекла деионизированной водой, просушивая их струей газообразного азота между промывками; после промывки водой дважды промойте их этанолом, снова просушивая струей газообразного азота между промывками.

С помощью многокарманной системы электронно-лучевого испарения нанесите слой титана толщиной 50 angstroms, а затем слой золота толщиной 150 angstroms. Не разгерметизируйте испаритель между нанесением слоя титана и слоя золота. Промойте штамп из PDMS этанолом и тщательно высушите.

С помощью потока азота наносите штамповочный раствор на штамп по каплям до полного покрытия поверхности. Тщательно просушите штамп струей азота. Микроконтактная печать гексадеканом зависит от характеристик ПДМС-штампа и является одним из самых сложных этапов данной процедуры.

Для успешного штампования необходимо освоить правильную технику, обеспечивающую равномерное давление. При штамповании, в случае стандартной микроконтактной печати на воздухе, осторожно прижмите штамп к золотой подложке и подождите 15 секунд до формирования монослоя.

В качестве альтернативы для паттернов, состоящих из очень мелких элементов с высоким аспектом, поместите золотую подложку в чашку Петри с деионизированной водой с удельным сопротивлением 18.2 mega ohm, убедившись, что подложка полностью погружена. Затем аккуратно прижмите штамп к золотой подложке и дайте монослою сформироваться в течение 15 секунд. После этого дважды промойте штампованную подложку этанолом и высушите потоком азота.

После каждого промывания поместите субстрат в чашку Петри и залейте его раствором для заполнения фона. Герметично закройте чашку с помощью парафильма для предотвращения испарения. Оставьте образец в темноте на 12–14 часов для формирования фонового монослоя.

Наконец, извлеките структурированное покровное стекло из раствора для заполнения обратной стороны и промойте его дважды этанолом, просушивая азотом после каждого промывания. Чтобы нанести белок на структурированное покровное стекло, поместите его в небольшую чашку Петри или камеру для культивирования клеток. Покройте образец от 500 µL до 1 mL фосфатно-солевого буфера без кальция и магния (DPBS). DPBS должен полностью покрывать подложку во время инкубации белка.

Для обеспечения равномерного покрытия белком добавьте концентрированный раствор белка в DPBS и перемешайте раствор, несколько раз пропипетировав его. Инкубируйте смесь белка с субстратом при 37 °C в течение одного часа. После инкубации тщательно промойте субстрат раствором DPBS для удаления несвязавшегося белка, стараясь не допустить высыхания субстрата и его соприкосновения с границей раздела фаз воздух-вода.

После трехкратного промывания аспирируйте DPBS. Затем добавьте примерно 500 µL полной среды для роста клеток, чтобы поддерживать субстрат во влажном состоянии. Замените среду для роста, использованную для промывания субстрата.

После добавления свежей среды субстрат готов к посеву клеток. Обычно на субстрат высевают от 30 до 200 клеток на квадратный миллиметр. На данном изображении представлен штамп из П-Д-М-С, визуализированный под микроскопом путем размещения штампа стороной с рельефом вниз на стеклянное покровное стекло; масштабный отрезок соответствует 100 micrometers.

Правильный перенос (стемпинг) обеспечивает получение четкого, выраженного белкового паттерна, который можно визуализировать путем нанесения флуоресцентно меченого белка, такого как фибронектин, меченный LOR 6 47. Здесь показано ограничение клеток chk one пределами белкового паттерна. Масштабные отрезки на этих изображениях соответствуют 100 micrometers.

В качестве альтернативы для визуализации паттерна белка после фиксации SU может быть использован метод иммуногистохимии. Здесь для визуализации паттерна ламината, на который были высеяны гиппокампальные нейроны мыши E 18, используются антитела к ламинату, конъюгированные с LOR three 50; показаны нейроны гиппокампа мыши E 18 на четвертый день in vitro. Окрашивание гиппокампальных нейронов мыши E 18 с помощью MIT tracker red five 80 демонстрирует, что рост клеток строго ограничен паттерном белка. Хотя этот метод легко освоить, могут возникнуть некоторые распространенные проблемы, что проиллюстрировано на данных препаратах паттерн-субстрата, визуализированных с помощью абсорбции фибронектина, конъюгированного с LOR 6 47.

Нанесение белка без достаточного перемешивания концентрированного белкового раствора в DPBS может привести к образованию неравномерных белковых структур. Неправильный перенос с помощью штампа может привести к частичному переносу структуры или деформации штампа. Кроме того, воздействие воздуха на подложку со структурой, содержащей абсорбированный белок, может нарушить монослой, что приведет к снижению сопротивления.

В качестве фона: метод погруженного структурирования позволяет создавать паттерны с мелкими элементами, которые трудно нанести с помощью традиционной микроконтактной печати на воздухе. На этих двух изображениях показаны разные области одного и того же паттерна, напечатанного с помощью одного и того же штампа из PDMS на воздухе или в деионизированной воде; на изображении слева показаны вспомогательные линии, демонстрирующие, что только мелкие элементы паттерна не были напечатаны успешно. Масштабные отрезки составляют 20 micrometers. При должном освоении эта техника может быть выполнена за 18–24 часа при соблюдении всех правил.

После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать процесс изготовления шаблонной подложки. Изготовьте штамп из PDMS. Используйте метод микроконтактной печати для подготовки золотой подложки с нанесенным рисунком и визуализируйте этот рисунок с помощью белков и клеток.