Cut-загрузки: полезный инструмент для изучения Протяженность Gap Муфта Tracer стыке нейронов сетчатки

Общая цель следующего эксперимента по нагрузке методом среза заключается в изучении степени сопряжения нейронов сетчатки через щелевые контакты в интактной сетчатке при контролируемых условиях освещения. Первый этап осуществляется путем разрезания сетчатки острым лезвием, погруженным в раствор нейробиотина — молекулы-трекера, способной диффундировать через открытые каналы щелевых контактов, но не через клеточные мембраны. На втором этапе сетчатки инкубируют в растворе Рингера, что обеспечивает диффузию трекера через открытые каналы щелевых контактов.

Если связь через щелевые контакты слабая, флуоресценция нейробиотина будет ограничена ретинальными нейронами, расположенными вблизи места разреза. Напротив, при сильной связи через щелевые контакты флуоресценция будет обнаруживаться в ретинальных нейронах, находящихся далеко от разреза. Основным преимуществом метода загрузки через разрез по сравнению с существующими методами является то, что его легче выполнять на нейронах с небольшими телами клеток в интактной ткани нейроретинального слоя.

Условия освещения при загрузке срезов контролировать также проще, чем при электрофизиологическом исследовании отдельных нейронов в интактной ткани сетчатки. Поскольку световые стимулы, используемые при электрической регистрации, сами по себе могут приводить к изменениям в связи через щелевые контакты, демонстрацию метода проведет доктор Чу Чой, постдок из моей лаборатории. В данной процедуре золотую рыбку содержат в постоянной темноте в течение дня не менее одного часа перед операцией, и все последующие этапы до момента фиксации ткани сетчатки также выполняются днем в постоянной темноте; глубоко анестезируйте золотую рыбку, добавив в воду аквариума 150 milligrams per liter метансульфоната.

Затем проведите эвтаназию золотой рыбки в соответствии с федеральными и университетскими правилами и осторожно извлеките глазные яблоки. Далее удалите переднюю часть каждого глазного яблока. Затем поместите кусочек фильтровальной бумаги на верхнюю часть заднего сегмента глаза и переверните бумагу вместе с глазом так, чтобы фильтровальная бумага оказалась под задним сегментом глаза.

Теперь аккуратно удалите заднюю часть глаза темноадаптированной золотой рыбки, включая склеру и пигментный эпителий. Перережьте зрительный нерв сетчатки парой тонких ножниц. После выделения интактной нейросенсорной сетчатки из задней части глаза, полученную нейросенсорную сетчатку золотой рыбки следует закрепить на фильтровальной бумаге фоторецепторной стороной вверх. Энуклеация проводится, пока рыба находится под воздействием анестезии; в каждую лунку шестилуночного планшета добавьте по 5 mL оксигенированного раствора Рингера на основе карбоната с исследуемым препаратом или без него.

Перенесите сетчатки в лунки в условиях постоянной темноты. Затем загерметизируйте лунки парафильмом и инкубируйте ткань в течение 30 минут. Непосредственно перед разрезанием сетчатки приготовьте 100 µL раствора трейсера, растворив 0,5% neuro biotin в растворе Рингера.

Затем добавьте раствор нейробиотина в стеклянную чашку Петри. После этого осторожно промокните фильтровальную бумагу, к которой прикреплена сетчатка, бумажным полотенцем. Чтобы удалить излишки раствора Рингера, окуните лезвие бритвы в раствор нейробиотина и сделайте перпендикулярный радиальный разрез через сетчатку и фильтровальную бумагу.

После этого снова окуните лезвие бритвы в раствор нейробиотина и сделайте второй разрез сетчатки. Повторите процедуру, сделав до четырех разрезов на одну сетчатку. На этом этапе перенесите сетчатку в свежий раствор Рингера или среду с исследуемым препаратом или без него на 15 минут для обеспечения нагрузки и диффузии.

Промойте образец трижды свежим раствором Рингера или средой с исследуемым препаратом или без него по пять минут за каждую процедуру. Затем зафиксируйте сетчатку в 4% параформальдегиде в 0,1 молярном фосфатном буферном растворе при комнатной температуре в течение одного часа. После этого промойте сетчатку в 0,1 молярном PBS в течение ночи при температуре четырех градусов Цельсия, поместив ее в холодильник до следующего дня.

Проведите реакцию сетчатки с 2% streptavidin Alexa 488 в 0,1 M PBS и 0,3% Triton X 100 до конечной концентрации 10 µg/mL и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. На следующий день промойте сетчатку трижды 0,1 M PBS при комнатной температуре, по 10 минут на каждую промывку.

Отделите сетчатку от фильтровальной бумаги в PBS. Затем с помощью тонкой кисти зафиксируйте сетчатку на предметном стекле с помощью среды для заключения Vector Shield, расположив её стороной фоторецепторов вверх. Поместите предметное стекло в лазерный сканирующий конфокальный микроскоп и сделайте снимки при одинаковом увеличении, разрешении и настройках для каждого экспериментального условия, чтобы можно было сравнить влияние различных условий на степень функциональной связи через щелевые контакты с использованием трейсера.

Здесь представлена степень связывания трейсера с фоторецепторными клетками в течение дня при постоянном отсутствии света по сравнению с аналогичными условиями в присутствии селективного антагониста дофаминовых рецепторов D2. Обратите внимание, что на обоих изображениях срез бритвой расположен слева. Хотя одно изображение может содержать все меченые клетки, рекомендуется собрать Z-стек интересующей области и объединить его в одно изображение, представленное здесь.

Здесь показана степень связывания трекера в фоторецепторных клетках при последовальном перемещении через такой срез Зака. Обратите внимание, что разрез бритвой на данном изображении находится справа. Чтобы количественно оценить степень связывания трекера в браузере LSM-изображений, откройте изображение, затем нажмите «экспорт» и сохраните изображение в виде несжатого 16-битного TIF-файла; масштабная линейка должна быть включена в это TIFF-изображение с помощью программного обеспечения NIH ImageJ.

Измерьте интенсивность флуоресценции нейробиотина, меченного Alexa 488, на изображениях сетчатки при малом увеличении (hole mount). Откройте TIFF-файл в программе Image J и проведите прямую линию, соответствующую масштабной линейке. Затем перейдите в меню Analyze, выберите Set Scale и введите известное расстояние и единицу длины.

Затем нажмите «ОК». Теперь результаты измерений флуоресценции могут быть представлены в калиброванных единицах, например, в миллиметрах. После этого выберите интересующую область с помощью инструмента прямоугольного выделения.

Пик флуоресценции должен быть расположен у левой границы выделенной области. Убедитесь, что вблизи правой границы отсутствует сигнал флуоресценции. Нажмите «analyze and plot profile» для данных дневного контроля, полученных в условиях постоянной темноты.

Слева направо отображается кривая с экспоненциальным затуханием. Затем нажмите «копировать» в появившемся окне и вставьте данные в Excel. Теперь доступны два столбца: один показывает расстояние от места разреза, а другой — интенсивность флуоресценции в зависимости от расстояния от места разреза.

Для сравнения вышеописанные этапы повторяют с данными, полученными в условиях постоянной темноты в дневное время. При наличии программы spit bro каждое исходное значение флуоресценции делят на максимальное значение флуоресценции для получения относительной интенсивности флуоресценции. Затем копируют два столбца, соответствующих расстоянию от среза и относительной интенсивности флуоресценции, и вставляют их в программное обеспечение Origin.

Эти этапы показаны как для дневного контроля, так и для дневного слюнного образца. На данном этапе данные приводят в соответствие с результатами с помощью функции экспоненциального затухания номер один; значения пространственной константы при различных экспериментальных условиях сравнивают с помощью T-критерия или ANOVA.

Для сравнения представлены экспоненциальные функции и статистический анализ данных контрольной группы в дневное время, группы с применением пипрона в дневное время и контрольной группы в ночное время. Здесь приведены примеры степени связи трейсера с фоторецепторными клетками в сетчатке золотой рыбки, адаптированной к темноте, в дневное время (A), в ночное время (B) и в дневное время в присутствии пипрона — селективного антагониста дофаминовых рецепторов D2, что было выявлено с помощью метода нагрузочного разреза. Все конфокальные изображения были получены с использованием одинаковых настроек для обеспечения корректности сравнения.

На этом графике интенсивность флуоресценции для трех экспериментальных условий представлена в зависимости от расстояния от места разреза и аппроксимирована экспоненциальной функцией. Метод нагрузки через разрез используется для количественной оценки степени сопряжения через щелевые контакты путем расчета значений пространственной постоянной, как показано здесь для трех экспериментальных условий. Метод нагрузки через разрез также может быть использован для исследования электрических синапсов между другими типами клеток сетчатки и у других видов.

Например, эти две фигуры иллюстрируют, что горизонтальные клетки типов А и В кролика демонстрируют гомологичную связь трассеров после нанесения методом разреза (cut loading) и диффузии нейробиотина в условиях темновой адаптации. Мы использовали метод нанесения через разрез для изучения степени диффузии трассеров через щелевые контакты между палочками и колбочками в дневное и ночное время. Кроме того, этот метод может быть использован для определения того, контролируется ли связь трассеров между другими нейронами сетчатки ретинальными часами и/или специфическими условиями освещенности.

Этот метод также может быть использован для изучения связи между нейронами в других областях мозга с помощью трейсеров.