Безлинзовой флуоресцентной микроскопии на чип

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать безлинзовую платформу для флуоресцентной микроскопии на чипе, предназначенную для получения изображений флуоресцентных объектов в сверхшироком поле зрения. Для этого тонкий абсорбционный фильтр и волоконно-оптическая лицевая панель аккуратно помещаются поверх матрицы оптоэлектронных датчиков, или CMOS-сенсора, после чего на лицевую панель устанавливается микрофлюидный чип. Затем с помощью иммерсионного масла с соответствующим показателем преломления призма соединяется с микрочипом.

Флуоресцентное возбуждение осуществляется через боковую грань ромбоэдрической призмы, а голографическое освещение — через верхнюю грань той же призмы. В конечном итоге, на основе полученных флуоресцентных изображений можно получить микроскопические изображения высокого разрешения путем декодирования исходных данных с помощью цифровых алгоритмов. При необходимости декодированные флуоресцентные объекты могут быть подсчитаны автоматически с помощью специально разработанного интерфейса.

Линза на чипе. В целом, целью визуализации является замена громоздких оптических микроскопов на базе линз более простыми и компактными конструкциями. Эта развивающаяся технологическая платформа обладает потенциалом устранить необходимость в объемных и дорогостоящих компонентах за счет использования новых теорий и алгоритмов цифровой реконструкции.

Список линз на платформе для визуализации на чипе включает несколько оптических компонентов, в том числе массив цифровых датчиков, некогерентный источник освещения, призму, абсорбционный фильтр, а также волоконно-оптическую лицевую панель или волоконно-оптический конус. В данной платформе для детектирования флуоресцентного сигнала от целевых микрообъектов могут использоваться различные типы сенсорных массивов. В данном видео будет использовано устройство с зарядовой связью, а для возбуждения флуоресценции применяется некогерентный источник света, такой как обычный светоизлучающий диод.

Для создания необходимого фона темного поля, как показано на этой схеме, параллельно используются два различных метода фильтрации возбуждения. Во-первых, стеклянная призма или стеклянный полушар используются для создания полного внутреннего отражения (TIR) на нижней поверхности микрофлюидного чипа, в котором находятся исследуемые образцы. Параллельно с этим используется недорогой абсорбционный фильтр для удаления слабо рассеянного света возбуждения, который не подвергается процессу TIR.

После успешного подавления возбуждающего излучения с помощью этих двух механизмов на плоскости детектора регистрируется только флуоресцентное излучение образцов. Несмотря на столь большую числовую апертуру детектирования, необработанные флуоресцентные пятна на матрице датчика становятся достаточно широкими, чтобы спроектировать и лучше контролировать пространственное распределение этого флуоресцентного сигнала. В качестве альтернативы обычному торцевому стеклу между плоскостями объекта и датчика будет установлено волоконно-оптическое торцевое стекло.

Конусообразная волоконно-оптическая лицевая панель, обладающая значительно более высокой плотностью волоконно-оптических кабелей на верхней грани по сравнению с нижней, может быть использована для получения изображений с более высоким разрешением за счет увеличения. Микрофлюидные чипы, используемые в данной платформе, изготавливаются с помощью стенок из полидиметилсилоксана, размещенных на предметных стеклах для создания микроканалов, необходимых для визуализации на чипе, чтобы начать сборку безлинзовой платформы для визуализации на чипе. Сначала снимите покровное стекло с матрицы оптоэлектронного датчика с помощью вакуумного пера, затем аккуратно поместите тонкий абсорбционный фильтр на верхнюю часть активной области детектора.

Расположите торцевую пластину оптоволокна поверх этого абсорбционного фильтра. Затем поместите изготовленный микрофлюидный чип непосредственно на массив оптоволокна. Далее над микрофлюидным чипом устанавливается стеклянная призма с использованием иммерсионной жидкости так, чтобы показатель преломления границы раздела совпадал с показателем преломления стекла.

Подключите источники света к волоконно-оптическим кабелям с помощью FC-коннекторов. Одним из наиболее сложных аспектов данной процедуры является юстировка компонентов. Тщательно выровняйте расстояния между компонентами, а также положение и угол освещения.

Наконец, переместите волокно бокового освещения ближе к призме и отрегулируйте его угол так, чтобы обеспечить полное внутреннее отражение на границе раздела стекло-воздух, соответствующей микрофлюидным чипам. С помощью данной платформы на чипе можно получать изображения нижнего субстрата, различных типов клеток или моделей мелких животных, однако для целей данной демонстрации будут визуализироваться лейкоциты. Чтобы пометить лейкоциты флуоресцентным красителем, сначала смешайте около 100 µL цельной крови с примерно 1 mL буфера для промывки эритроцитов, инкубируйте в течение около трех минут при комнатной температуре, затем центрифугируйте раствор лизированной крови.

После удаления верхнего слоя с помощью микропипетки ресуспендируйте осадок в фосфатно-солевом буферном растворе для маркировки нуклеиновых кислот клеток флуоресцентным красителем; добавьте SYTO 16 в суспензию, а затем инкубируйте образец в течение примерно 30 минут в темноте при комнатной температуре. Через 30 минут центрифугируйте маркированный образец. Удалите супернатант, чтобы снизить уровень фонового шума, вызванного флуоресцентным излучением несвязавшихся красителей.

Риз ресуспендировал осадок лейкоцитов примерно в пяти миллилитрах PBS. Теперь образец готов к загрузке в микрофлюидный чип для проведения безлинзовой флуоресцентной визуализации на чипе. Перед визуализацией лейкоцитов платформу визуализации необходимо откалибровать с помощью флуоресцентных микросфер.

Приготовьте разбавленный образец микросфер, используя деионизированную воду и исходный раствор сфер. С помощью шприца с острой иглой введите этот начальный образец в микрофлюидный чип со стороны стенок из PDMS.

После сборки компонентов для реализации флуоресцентной визуализации на чипе с помощью компьютера и специально разработанного интерфейса LabVIEW получите исходные изображения флуоресцентных микросфер. Убедитесь, что во всем поле зрения присутствует не менее 20 отдельных изображений флуоресцентных микросфер. Сохраните калибровочные данные, которые будут использованы позже для калибровки и извлечения функции рассеяния точки платформы безлинзовой флуоресцентной микроскопии.

Извлеките микрофлюидный чип с образцом флуоресцентных микросфер и отсоедините призму от этого чипа. Введите предварительно подготовленный образец лейкоцитов в другой неиспользованный микрофлюидный чип со стороны стенок из PDMS. Снова соберите компоненты, соблюдая те же экспериментальные условия, особенно в отношении расстояний и мощности возбуждения.

Получите необработанные изображения лейкоцитов с помощью специально разработанной системы LabVIEW, используя те же параметры программного обеспечения, что и для флуоресцентных микросфер. Затем калибровочные данные и необработанные изображения лейкоцитов используются для создания изображений с более высоким разрешением в MATLAB посредством цифровой обработки. Здесь для сравнения представлены репрезентативные результаты широкопольной флуоресцентной визуализации на чипе смеси, содержащей зеленые флуоресцентные частицы размером 4 мкм и 10 мкм, при 10-кратном увеличении микроскопа.

Также представлены изображения, полученные с помощью объектива, которые хорошо согласуются с показанными флуоресцентными изображениями без использования линз. Далее приведены результаты широкопольной флуоресцентной визуализации без линз смеси, содержащей зеленые и красные флуоресцентные частицы размером 10 микрон. Флуоресцентные изображения без линз достаточно точно соответствуют изображениям тех же образцов, полученным с помощью микроскопного объектива с 10-кратным увеличением.

На этом рисунке представлено сравнение эффективности деконволюции по методу Люси-Ричардсона и сжимающего сэмплинга на основе алгоритмов декодирования при визуализации различных пар микросфер размером 10 мкм. В верхнем ряду показаны необработанные флуоресцентные изображения, полученные без использования линз, где на врезках представлены сравнительные микроскопические изображения тех же частиц, полученные с использованием объектива 10x. В среднем ряду продемонстрированы результаты сжимающего декодирования, а в нижнем — результаты деконволюции по методу Люси-Ричардсона. DDCS и DLR относятся соответственно к расстояниям между центрами, микроскопическим изображениям, декодированным изображениям CS с использованием линз и изображениям без линз, подвергнутым деконволюции LR.

Далее демонстрируется цифровая обработка необработанных изображений с низкой флуоресценцией линзы. Для достижения пространственного разрешения менее 4 мкм используется алгоритм на основе сжимающего сэмплирования, который позволяет разрешить тесно расположенные пары микросфер диаметром 2 мкм. На врезках представлены сравнения с использованием микроскопического объектива 40x, которые очень хорошо согласуются с декодированными флуоресцентными изображениями.

Здесь D обозначает расстояние между центрами на изображениях, полученных с помощью микроскопа. В то время как DCS означает расстояние между центрами на изображениях без линз, декодированных с помощью CS. На данном рисунке представлены результаты беслинзовой визуализации флуоресцентно меченных лейкоцитов.

Исходные изображения безлинзовой системы быстро декодируются с помощью декодера на основе сжатого считывания (CS), результаты которого хорошо согласуются с обычным микроскопическим изображением того же образца, полученным с использованием объектива с увеличением 10 x. Помимо визуализации, при необходимости, декодированные флуоресцентные объекты могут быть автоматически подсчитаны с использованием специально разработанного интерфейса для приложений он-чип цитометрии. Здесь представлен специально разработанный автоматизированный интерфейс для подсчета флуоресцентных объектов в matlab. Мы продемонстрировали процедуру безлинзовой флуоресцентной микроскопии меченых клеток и микросфер в поле зрения площадью восемь квадратных сантиметров.

Такая платформа для визуализации чипов в сочетании с быстрым компрессионным декодером будет весьма эффективна для высокопроизводительной цитометрии, анализа редких микрообъектов и прикладных исследований живых клеток.