PDMS изготовление устройств и модификации поверхности

Меня зовут Кен Котц. Я postdoctoral fellow в Bio MAs Resource Center при Массачусетской больнице общего профиля. Мой основной исследовательский проект посвящен выделению нейтрофилов с помощью устройства иммуноаффинного захвата с микрофлюидными структурами.

Мы используем это устройство в пяти различных больницах по всей стране для выделения РНК с целью последующего геномного анализа. По сути, перед вами мастер-форма из фоторезиста SU8 на кремниевой подложке. Мы зальем на эту форму двухкомпонентный эластомер PDMS, и этот PDMS сформирует отливку.

Мы извлекаем мастер-форму из футляра и помещаем ее в чашку Петри. Мастер-форма закрепляется скотчем на дне чашки Петри. На весах мы отмеряем смесь PDMS, отвердителя и базовой смолы.

Соотношение составляет одна часть отвердителя на 10 частей смолы. Как правило, для наших вырезанных образцов мы взвешиваем от 20 до 30 г смолы и соответственно от двух до трех г отвердителя. После того как смола и отвердитель перелиты в небольшую навесочную лодочку, мы перемешиваем их с помощью обычной пластиковой вилки.

Необходимо тщательно перемешать смесь, складывая ее слоями, чтобы отвердитель равномерно распределился в смоле. Как правило, мы контролируем качество смешивания по количеству пузырьков воздуха, стараясь добиться их равномерного распределения по всему объему эластомера.

Затем мы выливаем PDMS поверх матрицы из SU-8, находящейся в чашке Петри. Мы помещаем матрицу с нанесенным на нее PDMS в вакуумный колокол и откачиваем воздух из камеры, чтобы удалить пузырьки воздуха, которые попали в смесь. Обычно процесс дегазации занимает от 30 минут до одного часа.

После дегазации мы извлекаем устройства из вакуумной камеры и помещаем их в печь при температуре от 65 до 80 °C. Минимальное время отверждения при таких температурах составляет от трех до шести часов. В нашей лаборатории мы обычно оставляем устройства в печи на ночь.

Обычно мы используем хирургический стальной скальпель №11. Мы делаем прямые разрезы примерно на полсантиметра от края силиконовой матрицы, обрезая её по периметру, чтобы получился большой диск. Затем мы отделяем форму из PDMS от матрицы и помещаем её стороной с рельефом вверх в чистую чашку Петри.

Мы извлекаем отделенную форму из чашки Петри и помещаем её на режущую поверхность, используя нож или нож, установленный на линейной направляющей. Мы разрезаем устройства, находящиеся на форме. Затем каждое отдельное устройство помещается обратно в чашку Петри для дальнейшей обработки.

Как правило, для обеспечения взаимодействия наших устройств с жидкостями мы пробиваем отверстия в устройстве из PDMS. Для пробивания отверстий используется стандартный шприц объемом 3 мл. На конце шприца объемом 3 мл находится тупоконечная игла из нержавеющей стали.

Внутри иглы из нержавеющей стали находится проволока, соответствующая внутреннему диаметру иглы. Эта проволока прикреплена к поршню шприца. Отводя поршень назад и извлекая иглу, можно пробить отверстие или вырезать пробку в PDMS. Переверните устройство из PDMS и извлеките его, нажав на поршень.

Секрет использования пробойников заключается в том, чтобы держать поршень максимально вертикально и совершенно не вращать устройство. Чтобы пробить PDMS, поднимите всё устройство, весь образец из PDMS пинцетом, переверните его и вытолкните пробку, нажав на поршень. Захватите пробку пинцетом и утилизируйте её.

Затем снова отведите плунжер назад, верните устройство в исходное положение и извлеките просекатель. Повторяйте эти действия до тех пор, пока не будут пробиты все необходимые отверстия. Что касается процесса склеивания, мы прикрепляем наши устройства из PDMS к предметным стеклам.

Для наших устройств мы будем выполнять необратимое соединение или ковалентное прикрепление PDMS к предметным стеклам. Это достигается путем помещения их в плазменный резак (плазменный печь) и воздействия на них реактивной кислородной плазмы. Таким образом, эта процедура состоит в том, чтобы взять устройство из PDMS и поместить его на поднос плазменного резака.

Разместив устройство элементами управления вверх, вы сможете использовать любой стандартный предметное стекло для микроскопа. Для нашего устройства мы используем слегка увеличенное предметное стекло размером в полтора дюйма. Их можно использовать сразу после извлечения из упаковки.

Мы рекомендуем подвергнуть их обработке раствором Пиранья. Это позволяет удалить любые органические загрязнения, которые могут находиться на поверхности предметного стекла. После размещения устройства и предметного стекла на подносе для плазменного печи-асшера (plasma Asher), задвиньте поднос внутрь установки и подвергните образцы воздействию реактивной кислородной плазмы.

После завершения программы работы плазменного очистителя (Asher) мы открываем камеру и переносим пластину с устройствами на рабочий стол. С помощью пинцета мы осторожно поднимаем устройство из PDMS, стараясь не касаться пальцами поверхностей склеивания. Мы переворачиваем устройство стороной склеивания на предметное стекло, после чего убеждаемся в отсутствии пузырьков воздуха между PDMS и предметным стеклом.

Теперь мы помещаем устройство из PDMS, прикрепленное к стеклу, на нагревательную плитку при температуре от 65 до 75 °C на 10 минут для обеспечения более прочной химической связи. В этом разделе мы проведем химическую модификацию поверхностей PDMS и стекла; после склеивания в чистом помещении мы получаем поверхность PDMS, содержащую реакционноспособные группы -OH. Нам необходима эта реакционноспособная поверхность, так как она является гидрофильной, хотя со временем она диффундирует в объем PDMS.

Поскольку модификацию химии поверхности лучше всего проводить сразу после плазменной обработки, мы будем использовать 5% раствор (3-меркаптопропил)триметоксисилана. Это 5% раствор по объему; мы вводим его через входное отверстие, следя за тем, чтобы устройство было полностью заполнено без образования пузырьков воздуха.

Если присутствуют пузырьки воздуха, удалите их с помощью пинцета. После инъекции slan оставьте образец на 15–30 минут при комнатной температуре. Обычно вторую порцию slan вводят через 10 минут после начала реакции.

После того как силан отреагирует в течение примерно получаса, мы промоем все устройства тремя-четырьмя объемами чистого этанола. Излишки вытекающей жидкости следует удалить с помощью безворсовой салфетки. После промывки устройств мы перенесем их на нагревательную плитку, установленную на 100 °C, и дадим этанолу испариться. Это способствует закреплению силанизированной поверхности.

После высушивания устройство можно хранить в эксикаторе в течение нескольких месяцев или же сразу перейти к следующему этапу. После отверждения устройств на поверхностях стекла и PDMS образуется слой силана. Используемый силан представляет собой каптосилан с тиольной группой, которая будет взаимодействовать с нашим гетеробифункциональным кросслинкером — GMBS.

Его разводят в чистом этаноле. Вещество реагирует с водой, поэтому необходимо следить за тем, чтобы оно не подвергалось воздействию водных сред. Мы вводим его в устройства и удаляем все пузырьки воздуха пинцетом, как я делаю сейчас, чтобы убедиться, что все поверхности покрыты этой молекулой.

Мы накрываем устройство и оставляем его реагировать на полчаса. После того как GMBS подействует в течение получаса, мы промоем устройства деионизированной водой, чтобы удалить все следы этанола. Затем мы пропустим раствор neutravidin, который представляет собой биотин-связывающий белок.

Затем раствор нейтравина предварительно разбавляют до концентрации 10 µg/ml. Если в устройство случайно попадет воздух, его потребуется повторно промыть этанолом для эффективного удаления всех воздушных пробок; этанол лучше смачивает поверхности устройства, что позволяет удалить любые случайно попавшие внутрь пузырьки воздуха. После того как устройства будут промыты деионизированной водой, мы обычно заполняем их раствором разбавленного нейтравина в объеме, равном двум-четырем рабочим объемам устройства.

Nutt travain будет реагировать с GMBS, который иммобилизован на поверхности любым первичным способом на Nutt travain. Этот процесс может протекать при комнатной температуре в течение одного часа. Обычно я помещаю устройства в холодную комнату при температуре 4 °C на ночь.

Однако перед добавлением антитела необходимо вымыть весь несвязанный в растворе Aden. Для этого мы пропускаем 1% раствор BSA, разведенный в PBS. Поскольку эти чипы будут использоваться для последующего геномного анализа, все используемые нами растворы не содержат РНК.

Как правило, мы промываем устройство четырьмя-пятью объемами 1% BSA раствора. После этого мы добавляем антитело. В данном эксперименте используются антитела к CD 66 B, которые специфичны для гранулоцитов в цельной крови.

Мы используем концентрацию в диапазоне от 10 до 25 µg/mL и вводим антитела. В каждое устройство вводится 200 µL антител. Мы выполняем два введения по 100 µL, по одному в каждый порт устройства.

Обычно мы вводим 100 µL в один порт, выжидаем 30 минут, а затем вводим еще 100 µL в противоположный порт.