Сотовые Захват Использование микрожидкостных устройств

Подготовленные нами устройства упакованы в наборы по 10 или 20 штук; при доставке они перевозятся в охлажденном виде в специальном боксе, а сам набор содержит все компоненты, необходимые для проведения эксперимента. В состав набора входит пакет со всеми шприцами и буферами, которые могут храниться при комнатной температуре. Также прилагается копия протокола, которому мы будем следовать в данном эксперименте.

Также имеется охлажденный контейнер, в котором находятся сами устройства и все рабочие буферы, требующие хранения при пониженной температуре. Обычно наборы упакованы группами по 10 или 20 штук. В периоды, когда наборы не используются, их следует хранить в холодильнике.

Каждый шприц и каждый компонент набора тщательно промаркированы, и эти метки соответствуют таблице в протоколе, которому мы следуем. Таким образом, исключена неоднозначность в том, какой шприц или компонент набора следует использовать на отдельных этапах. После распаковки устройств и их помещения в бокс биологической безопасности мы приступим к процедуре выделения нейтрофилов и их лизиса для последующего геномного анализа, так как полученный клеточный лизат будет использован для выделения или экстракции RNA.

По этой причине мы должны убедиться, что наша рабочая зона чиста не только в стерильном смысле, но и очищена от любых РНК, которые обычно присутствуют в окружающей среде. Поэтому крайне важно протереть всю рабочую область и оборудование раствором, разрушающим РНК. Как правило, мы обрабатываем все инструменты и рабочие поверхности средствами RNA SAP или RNase AWAY, которые можно приобрести у ряда производителей.

Устройство поставляется в герметичном термопакете. Каждое устройство запечатано и имеет штрихкод. Вам следует записать этот штрихкод, если вы работаете с клиническими образцами.

Таким образом, устройство распечатано, крышка снята, и оно помещено в фиксирующее устройство насоса. В качестве образца крови мы используем образец цельной крови. Мы пропустим его через стандартный шприц BD объемом 1 мл, который обозначен как «шприц 1».

Обычно процедура выполняется следующим образом: шприц извлекают из упаковки и осторожно снимают колпачок с пробирки с кровью. Затем в пробирку отбирают 700 µL или 0,7 мл крови, после чего половину этого объема, то есть 350 µL, вводят в пробирку объемом 1,5 мл. Таким образом, кровь можно передать для дальнейшей обработки.

Вашу пробирку с кровью можно передать далее, и при этом у вас останется запас крови на случай сбоя в работе устройства. Теперь мы установим шприц с кровью на эту иглу, которая соединена с отрезком трубки и этим устройством. Нам нужно быть очень осторожными с этим микрофлюидным устройством для изоляции.

Необходимо быть очень осторожными, чтобы не допустить попадания пузырьков воздуха в устройство, иначе оно будет работать неправильно. Обычно мы берем шприц, нажимаем на поршень и добавляем жидкость на верхнюю поверхность устройства, убеждаясь, что она полностью смочила поверхность до того, как вся жидкость будет выдавлена. После этого мы останавливаемся и осторожно отделяем корпус шприца от иглы, заполняя кончик иглы или разъем Люэра иглы оставшимся в шприце буфером.

Мы утилизируем это. Затем мы берем шприц с кровью и вводим его в этот разъем с переходником, стараясь не пролить кровь и не допустить попадания пузырьков воздуха.

Рекомендуется использовать салфетку, удерживая корпус шприца и трубку на случай проливания крови. После того как шприц будет подключен к корпусу трубки или игле, по нему несколько раз резко постукивают, чтобы удалить пузырьки воздуха, которые могут находиться в месте соединения. Затем шприц устанавливают в шприцевой насос и фиксируют стопорным винтом.

Шприцевой насос включен и уже настроен на необходимые условия потока. Мы будем подавать кровь через устройство со скоростью 30 µL в минуту. После установки корпуса шприца в насос необходимо нажать кнопку на подвижном рычаге поршня и сдвинуть его вниз до касания верхней части поршня, чтобы началась подача жидкости через наконечник.

Это тупоконечная игла из нержавеющей стали. Убедившись, что система заполнена, мы нажмем кнопку запуска. Чтобы начать ток крови, нажмите «стоп» для его прекращения, затем возьмите чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл или пробирку Falcon и осторожно отсоедините трубку.

Отсоедините только одну трубку от одного из портов устройства. После отсоединения трубки вставьте ее в центрифужную пробирку объемом 1.5 мл. Нажмите кнопку запуска, чтобы возобновить поток крови.

Когда появится капля крови, мы останавливаем насос и вводим ее во входное отверстие, которое только что открыли в устройстве. Затем мы нажимаем «пуск» для начала тока крови и устанавливаем таймер на пять минут. Нам необходимо убедиться, что кровь равномерно заполняет все камеры и в устройстве нет явных пузырьков воздуха.

Если в любом из каналов, ведущих в камеры захвата или выходящих из них, образовались пузырьки воздуха, блокирующие поток, их можно удалить, аккуратно проведя пинцетом вдоль этих малых каналов. Устройство заполняется равномерно, поэтому через пять минут нажмите кнопку остановки на шприцевом насосе, чтобы прекратить подачу крови, ослабьте зажим шприца и извлеките его из держателя насоса. Затем мы возьмем шприц номер три, заполненный PBS без нуклеаз. Мы снова убедимся, что поверхность устройства увлажнена для предотвращения появления пузырьков воздуха, и постучим по шприцу, чтобы все пузырьки воздуха поднялись в верхнюю часть корпуса шприца.

Ослабьте фиксатор на шприцевом насосе и вставьте шприц объемом 3 мл в насос. Затяните фиксатор, затем нажмите на плунжер до его соприкосновения с поршнем шприца. Нажмите кнопку запуска и дождитесь заполнения устройства жидкостью, пока на кончике иглы из нержавеющей стали не появится капля.

Когда вы увидите образование капли, остановите насос. Теперь извлеките из устройства наконечник из нержавеющей стали с кровью. Вставьте промывочный буфер и нажмите кнопку запуска.

Оставьте систему работать в течение пяти минут. С помощью чистой салфетки удалите небольшое количество крови, которое может находиться на входе или выходе. После пятиминутной промывки устройства промывочным буфером вся кровь должна быть полностью удалена; это можно определить по тому, что в устройстве не останется красной крови и оно будет выглядеть прозрачным. Таким образом, по истечении пяти минут мы прекратим подачу промывочного буфера.

Затем мы снимаем шприц с шприцевого насоса. Мы закрываем крышкой микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл, закрепив её непосредственно на гибкой выпускной трубке. После этого мы осторожно приподнимаем микроцентрифужную пробирку, вытягивая трубку для отходов из устройства.

Мы выбросим это в контейнер для биоопасных отходов. В комплект входит новая выпускная трубка, которая фактически изготовлена из тефлона. Она также имеет наконечник из нержавеющей стали.

Мы заменим старую выпускную трубку на эту новую выпускную трубку. Возьмем выпускную трубку и постараемся согнуть ее в форме буквы U или V. Также в комплект входит колонка для измельчения Kaya, которая осуществляет сдвиг ДНК и, по сути, гомогенизирует ваш клеточный лизат.

Теперь мы откроем фиолетовую крышку колонки для измельчения и вставим выходную трубку в колонку Kay Shredder. Из набора мы возьмем шприц номер два, предназначенный для RLT. Это стандартный шприц BD объемом 1 мл с тупоконечной иглой из нержавеющей стали калибра 22G.

Мы будем использовать этот инструмент, чтобы ввести 350 µL стандартного буфера RLT от kyogen в устройство. Поскольку устройство имеет мертвый объем около 50 µL, нам необходимо ввести RLT, а затем за ним ввести воздушную пробку, чтобы вытеснить этот мертвый объем устройства в колонку с измельчителем chi. Для этого мы возьмем шприц, наберем 350 µL воздуха, а затем 350 µL или 0,35 мл RLT, так что RLT окажется в нижней части шприца.

Не поддавайтесь искушению перевернуть шприц и ввести воздух. Воздух необходим для того, чтобы весь RLT попал в колонку измельчителя Kay. Теперь мы извлечем трубку из промывочного буфера.

Мы вводим шприц с RLT и медленно впрыскиваем RLT в устройство в течение примерно 30 секунд, следя за тем, чтобы через выпускную трубку отходы выходили в колонку Kay Shredder. Как только в устройство начнет поступать воздух, нажмите на плунжер и подождите, пока вся жидкость выйдет в колонку Kay Shredder. Мы извлекаем колонку Kay Shredder и центрифугируем ее в микроцентрифуге с использованием противовеса при 15 000 RPM или на максимальной скорости в настольной микроцентрифуге в течение двух минут.

После центрифугирования колонки в течение двух минут мы извлекаем из неё образец, который сейчас находится в буфере RLT, и помещаем его в одну из прилагаемых криопробирок с фиолетовой крышкой. Если вы работаете с клиническим образцом, используйте такие криопробирки, промаркировав их в начале эксперимента. Вот лизат в криопробирке.

Данную криопробирку следует немедленно поместить в морозильную камеру при -80 °C для хранения перед отправкой или последующей экстракцией РНК. Таким образом, это альтернативный протокол изоляции нейтрофилов. Вместо лизиса клеток с помощью буфера RLT мы проведем их окрашивание стандартным гистологическим красителем.

Окрашивание. Мы извлекаем герметично упакованное устройство из пакета и распаковываем его; затем фиксируем номер лота изделия и помещаем чашку Петри в держатель для чашек Петри.

Мы возьмем шприц объемом 1 мл из упаковки (шприц номер один), наберем в него 700 µL крови и введем половину объема, 350 µL, в пробирку с DPH. Отставим ее в сторону. Затем возьмем шприц четыре с присоединенной трубкой, которую мы будем использовать для ввода, и введем кровь в устройство.

Основание иглы закрепите на конце трубки с помощью химического метода. Снимите корпус шприца и заполните люр. Адаптер будет служить буфером, после чего данный шприц следует утилизировать.

Мы вставим шприц с кровью в иглу, используя салфетку для химических работ, чтобы собрать возможные капли. Мы постучим по шприцу, чтобы удалить пузырьки воздуха в месте соединения иглы и корпуса шприца. Мы установим шприц в шприцевой насос и заполним систему, нажав на подвижный рычаг насоса.

Мы отсоединим трубку от одного из выходов устройства (устройства захвата) и поместим её в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Затем мы начнем подачу крови, нажав кнопку «run» на шприцевом насосе. Дождитесь образования капли крови на наконечнике из нержавеющей стали.

Как только сформируется капля, нажмите кнопку остановки, удалите излишки крови, вставьте ее в устройство и нажмите кнопку запуска. Теперь установите таймер на пять минут. После того как раствор будет проходить через устройство в течение пяти минут, нажмите кнопку остановки на шприцевом насосе и извлеките шприц.

Затем мы заменим этот шприц на шприц объемом 3 мл с промывочным буфером, который представляет собой 1×PBS. Снова убедитесь, что верхняя часть устройства герметично закрыта, после чего извлеките кончик иглы с кровью или сбегом. Начните заполнение устройства.

Когда капли сформированы, мы вставляем устройство и нажимаем кнопку запуска, удалив остатки крови на входном или выходном трубках; после этапа промывки мы дадим раствору протекать в течение пяти минут. Затем мы снова остановим шприцевой насос и извлечем шприц из держателя насоса. Для стандартного окрашивания GIM мы сначала зафиксируем клетки и дегидратируем их, используя 100% methanol.

Таким образом, у нас есть шприц объемом 3 мл, предварительно заполненный метанолом. Снова подготовим шприц, убедимся, что метанол поступает, остановим шприцевой насос, вставим его в устройство и нажмем кнопку запуска. Мы будем фиксировать их в этом растворе метанола в течение двух-четырех минут.

После двух-четырех минут фиксации и промывки метанолом мы останавливаем насос, сливаем метанол из шприца, а затем загружаем в шприц объемом 3 мл стандартный краситель EEM Sustain от Sigma, разведенный в деионизированной воде в пропорции 1:5. После разведения мы заполнили шприц и установили на его конце фильтр 0,8 мкм, чтобы удалить любые частицы, которые могли бы привести к засорению устройства. Окрашивание проводят в течение 5–10 минут.

Затем мы промоем устройство деионизированной водой. Спустя 5–10 минут окрашивания мы остановим шприцевой насос и заменим шприц с буфером для окрашивания на шприц с деионизированной водой; мы будем проводить промывку до тех пор, пока синий цвет SAI не вымоется из устройства. Как только излишки gim sustain будут удалены из устройства, мы остановим подачу промывочного раствора.

Затем мы извлечем шприц с водой из входного отверстия. После этого мы возьмем выходную трубку устройства и зажмем ее конец пинцетом.

Это гибкая трубка из тигона, которую мы сейчас вставим обратно во входное отверстие устройства. Это обеспечит герметизацию устройства, поддержит гидратацию клеток и сохранит их морфологию. Теперь мой коллега, доктор Джон Хонг Чанг, продемонстрирует альтернативный протокол выделения CD4-положительных лимфоцитов с последующим иммунофлуоресцентным окрашиванием непосредственно внутри микрофлюидного устройства.

Меня зовут Шон Хонг, и сегодня я продемонстрирую вам метод окрашивания клеток в микрофлюидном устройстве. Ранее вам уже было показано, как использовать микрофлюидное устройство для иммуноаффинного выделения, чтобы специфически изолировать клетки крови из необработанной цельной крови. Для этой цели может потребоваться лизировать клетки и выделить белки и ДНК из этих изолированных клеток. Что касается моих исследований, меня интересует получение самих клеток с последующим их подсчетом — например, для определения количества CD4+ клеток в цельной крови с целью использования этого показателя в диагностике.

Таким образом, используемое устройство очень похоже на прибор Кена. Оно представляет собой камеру из PDMS. Геометрия немного отличается, поэтому рабочие параметры несколько иные, хотя в целом общая процедура работы очень схожа.

Я пропущу все этапы захвата и промывки клеток и перейду непосредственно к этапу окрашивания клеток в процедуре подсчета. Перед нами устройство, в котором уже захвачено некоторое количество клеток из цельной крови и которое уже промыто PBS. Таким образом, лишние клетки уже вымыты из устройства, и я заранее подготовил смесь антител, которая используется специально для маркировки клеток, изолированных в устройстве.

Концентрация антител, которую мы использовали в данном случае, была оптимизирована для окрашивания клеток с очень высокой интенсивностью флуоресценции при исследовании под флуоресцентным микроскопом. Сама процедура достаточно проста. Мы устанавливаем шприц, заполненный раствором антител, в шприцевой насос, а затем убеждаемся, что скорость потока установлена в соответствии с необходимыми параметрами.

Затем мы запустим шприцевой насос и проследим за концом трубки, чтобы убедиться, что раствор уже поступает и в трубке больше нет пузырьков воздуха. После этого трубку можно подключить к микрофлюидному устройству, в котором захвачены клетки. Таким образом, антитела начинают поступать в устройство для окрашивания клеток, которые мы изолировали внутри него. В данном случае я использую скорость потока 5 µL/min, однако в зависимости от геометрии устройства для ваших целей могут потребоваться иные параметры потока.

Затем мы будем подавать раствор антител в течение пяти минут, чего достаточно для замещения всего объема раствора внутри микрофлюидного канала. После инъекции антител поток будет остановлен. Таким образом, мы подаем антитела со скоростью 5 µL/мин в течение пяти минут, чтобы полностью заменить раствор в микроканале.

После этого мы останавливаем поток и оставляем устройство инкубироваться при комнатной температуре в течение 30 минут. Инкубацию следует проводить в темноте, чтобы избежать тушения флуоресцентных антител во время их взаимодействия с клетками. Таким образом, после окрашивания, которое обычно длится от 15 до 30 минут, мы отсоединяем трубки от устройства и заменяем шприц с антителами на шприц с буфером, чтобы вымыть из устройства несвязавшиеся антитела.

Таким образом, используемый здесь промывочный раствор представляет собой 1% BSA в растворе PBS. BSA применяется для блокирования неспецифического связывания антител на поверхности, и мы поступим так же. Сначала мы отрегулируем скорость потока на шприцевом насосе, чтобы убедиться в ее соответствии заданному значению, затем запустим насос и убедимся, что жидкость действительно поступает из трубки, прежде чем подключать ее к устройству.

Это делается для того, чтобы в трубках не оставалось пузырьков воздуха. Таким образом, при инъекции в устройство не попадут пузырьки. Мы просто подключаем трубку к устройству и обеспечиваем поток в течение еще пяти минут, чтобы вымыть из устройства весь несвязавшийся антитело.

После этапа промывки мы зафиксируем клетки 1% PFA. Это делается для того, чтобы устройство можно было хранить в течение нескольких недель, если визуализация не проводится сразу. Таким образом, процедура достаточно проста.

Этот процесс аналогичен тому, что мы выполняли ранее. Мы устанавливаем шприц в помпу, настраиваем скорость потока на нужное значение, затем запускаем шприцевой насос и подключаем трубку к нашему устройству, чтобы ввести раствор параформальдегида (IDE), который служит фиксатором, для фиксации клеток в устройстве. Снова оставляем раствор протекать в течение примерно пяти минут.

Таким образом, PFA замещает весь буфер в устройстве, чтобы зафиксировать все находящиеся в нем клетки. После этапа фиксации PFA шприц с PFA снимают, и устройство становится готовым к визуализации. В некоторых случаях исследователи проводят окрашивание ядер, чтобы наложить полученное изображение на окрашивание маркеров клеточной поверхности.

Для этой цели в конце будет проведено окрашивание ядер с помощью DPI. Мы загружаем шприц с DPI, включаем шприцевой насос и подаем DPI в устройство. Таким образом, ядра в этих клетках будут окрашены, что позволит определить их местоположение.

Таким образом, изображение с окрашиванием DPI можно будет впоследствии наложить на изображение с окрашиванием поверхностных маркеров, чтобы определить локализацию клеток. По завершении окрашивания DPI необходимо снова удалить несвязавшийся DPI с помощью буферного раствора. Для этого мы опять используем PBS, содержащий 1% BSA, чтобы вымыть несвязавшийся DPI.

Процедура аналогична той, что мы выполняли ранее. Мы просто подключаем шприц с буфером к устройству и пропускаем буфер через него, чтобы вымыть несвязавшийся dap. Таким образом завершается процедура окрашивания клеток в микрофлюидном устройстве.

После завершения всех процедур окрашивания устройства готовы к визуализации. Поскольку была проведена фиксация PFA, устройства также могут храниться в течение нескольких недель, если визуализация не может быть выполнена сразу.