Микрожидкостных устройств с Groove Шаблоны для изучения Сотовая Поведение

Меня зовут Цзян, я стипендиат-постер Гарвардского университета и Массачусетского технологического института в области здравоохранения, науки и технологий. Моя специализация в этой лаборатории заключается в создании инновационных микрофлюидных устройств для изучения поведения клеток. Я могу разрабатывать новые устройства для создания градиентов, а также интегрировать их в свои микрофлюидные системы.

Устройство TC позволяет точно управлять взаимодействием клеток между собой, а также контактом клеток с внеклеточным матриксом. Таким образом, используя систему TC, я могу изучать основы клеточной биологии, а также применять эти знания в биологии развития и биоинженерии стволовых клеток. Меня зовут Амир Манчи, я студент бакалавриата в лаборатории профессора Хана в подразделении медицинских наук и технологий (Division of Health Sciences and Technology) Гарварда и MIT.

Я работаю с микрофлюидными устройствами, и в качестве подтверждения концепции мы стремимся показать, что такие устройства обладают огромным потенциалом для культивирования клеток и проведения различных исследований, например, по определению токсичности. Кроме того, мы пытались изучить и оптимизировать характеристики жидкости внутри этих устройств в зависимости от скорости потока, геометрии и других различных параметров. Сейчас мы находимся в помещении для микрофабрикации, где мы собираемся изготовить несколько микрофлюидных устройств. Для создания таких устройств нам потребуются шаблоны на кремниевых пластинах и формы из PDMS, наложенные поверх них. Этот полимер PDMS фактически представляет собой смесь двух различных компонентов.

Это смесь основы из силиконового эластомера и отвердителя для силиконового эластомера. Мы смешиваем эти два компонента в соотношении 10:1, то есть 10 частей основы и одна часть отвердителя. Сейчас мне потребуется около 20 g основы.

Мне также понадобятся два грамма отвердителя; плотность отвердителя значительно ниже. Он будет выливаться гораздо быстрее, поэтому мне нужно быть осторожным. Сейчас примерно 22 градуса, и я приступаю к смешиванию основы и отвердителя.

Для этого я воспользуюсь пипеткой. Я постараюсь максимально тщательно перемешать смесь. Затем я залью этот полимер PDMS на кремниевые пластины, на поверхности которых уже нанесен рисунок; кремниевая пластина служит шаблоном для создания структуры форм из PDMS.

Вы можете заметить, что у меня здесь две кремниевые пластины; это связано с тем, что одна из них предназначена для верхнего слоя нашего микрофлюидного устройства, а другая — для нижнего. В микрофлюидных устройствах необходимы два слоя, поскольку мы создаем внутри канал, а основная цель разработки таких устройств заключается в обеспечении потока жидкости внутри этих каналов. Мне нужно вылить эту смесь на обе кремниевые пластины, так как в смеси содержится много пузырьков воздуха.

Мне необходимо удалить эти пузырьки, и для этого мы используем вакуум. Мы вернулись в основную рабочую зону лаборатории; как я уже упоминал, в смеси PDMS образуется много пузырьков, которые нужно удалить, поэтому я помещу смеси на кремниевые пластины внутри вакуумной камеры. Я закрою камеру и включу вакуумный насос. После этого мы поместим формы из PDMS в печь на ночь, чтобы они затвердели.

Итак, мы находимся в лаборатории и приступаем к сборке этих микрофлюидных устройств. Мы возьмем формы из PDMS, которые находились в инкубаторе в течение ночи, в результате чего на них отпечатались паттерны с кремниевых пластин; я буду использовать два разных паттерна. Слева вы видите микроканал, который станет верхним слоем, а справа — зеленые линейные паттерны, которые станут нижним слоем.

Это сформирует канавки внутри микроустройства. Я начинаю с разрезания этих гелей, чтобы верхний слой легко отделялся от кремниевой пластины. После этого я перенесу его в чашку Петри лицевой стороной вверх, чтобы рисунок был направлен вверх.

То же самое я сделаю для желобков, которые были обозначены зелеными линиями. Они сформируют нижний слой. После вырезания геля я перенесу его в чашку Петри и, чтобы предотвратить попадание пыли на паттерны, заклею их скотчем.

Следующим этапом является пробивание отверстий на концах каналов для обеспечения притока и оттока клеток и среды. Поскольку поверхность здесь широкая и я не вижу сами паттерны, я воспользуюсь этим приспособлением, чтобы видеть каналы и пробить оба конца. С одной стороны я пробиваю большое отверстие, чтобы был определенный запас, а с другой стороны — маленькое отверстие, чтобы можно было использовать полиэтиленовые трубки.

Сейчас мы находимся в помещении для микрофабрикации, и следующим шагом будет соединение двух имеющихся у нас различных поверхностей. Для этого используется данный прибор, называемый установкой для плазменной очистки, а сам процесс называется плазменной обработкой. Внутри этой камеры создается плазменная среда; при взаимодействии плазмы с поверхностью происходит разрыв слабых поверхностных связей, на месте которых образуются высокореактивные химические группы.

Теперь я сниму ленты, которые были наклеены здесь для защиты от пыли, и помещу эти формы внутрь камеры. Я полностью закрою дверь, сначала включу питание, затем насос, и мы будем готовы к работе. Мы продолжим через 5–10 минут.

Теперь я хочу выключить систему, поэтому я выключаю насос и питание, после чего открываю камеру. На самом деле, здесь поддерживается отрицательное давление, поэтому вы можете услышать характерный звук. Это происходит из-за отрицательного давления, поэтому я медленно извлекаю свои формы.

Поскольку обе поверхности с рисунком обращены вверх, я возьму нижний слой в левую руку, переверну верхний слой, помещу его поверх своих канавок, а затем прижму слои друг к другу. Преимуществом использования данного аппарата для плазменной обработки является прочность и долговечность адгезии. Сейчас вы можете видеть канал на верхнем слое и структуру канавок на нижнем слое; образец готов к следующему этапу.

Затем перенесите в помещение для культивирования чашку с питательной средой и откройте крышку. После этого можно приступать к загрузке фибронектина: возьмите 60 µL фибронектина и введите его в устройство. Чтобы создать внутри устройства поток для равномерного покрытия стенок канала фибронектином, осторожно примените вакуумное отсасывание на выходе.

После этого устройство помещают в инкубатор на один час. По истечении одного часа инкубации при постоянном перемешивании образец извлекают из инкубатора, затем используют три фильтра для центрифугирования и декантирования. После этого добавляют среду и проводят подсчет клеток с помощью счетчика клеток.

Обычно мы используем миллион клеток, находящихся внутри устройства. Таким образом, после диссоциации можно несколько раз продуть систему, затем собрать суспензию клеток и ввести ее в канал. Для более эффективного размещения клеток внутри канала можно использовать осторожную прокачку с помощью аспиратора.

Среда и поверхностная суспензия аспирируются через выходной порт с клетками, что обычно автоматически приводит к заселению селективного глобального канала. После этого систему можно разобрать и поместить в инкубатор на один час, пока клетки полностью не распределятся внутри канала. Затем можно ввести Annexin V и пропидиййодид, а также перекись водорода.

Затем проведите анализ для проверки вашей гипотезы о времени. Мы можем взять образец в среде для культивирования тканей, после чего приготовим раствор, содержащий 2 мл среды DMEM, а также 20 мкл Annexin V, 40 мкл пропидийиодида и 100 мЛ перекиси водорода. Затем возьмите 2 мл среды с Annexin V, пропидийиодидом и перекисью водорода и введите их с помощью шприца.

Добавьте две единицы среды mill и пять единиц пропидиййодида (PI) и гидропероксида. Раствор можно просто поместить в шприц, удалить пузырьки воздуха, а затем подсоединить C-bear. В данном случае используются газоплотные шприцы Hamilton warm mill.

Это — трехмиллиметровая пробирка. Это — одноразовые предметные стекла. Это — игла 27 G.

Это полиэтиленовая трубка PE 20. После набора раствора в шприц несколько раз полностью вытолкните содержимое, затем слегка постучите по шприцу, чтобы удалить пузырьки воздуха, и снова наберите раствор. Еще раз: полностью вытолкните жидкость, удалите пузырьки, а затем аккуратно повторите процедуру.

Возьмите раствор для одной порции, после чего переключите клапан. Протолкните раствор через трехходовой кран и далее по трубке. В итоге раствор выйдет через кончик трубки, после чего трубку можно подключить к микроустройству и начать инфузию со скоростью 1 µL в минуту.