Визуализация эстрогеновых рецепторов-α в Крыса пиальных Артериолы использованием цифровой микроскоп иммунофлуоресцентного

Общая цель данной процедуры — описание простого метода оптимизации окрашивания и визуализации рецептора эстрогена альфа с использованием поперечных срезов артерий коры, полученных из головного мозга самок крыс. Это достигается путем предварительного извлечения окрашенных красителем Эванса синего артерий коры с поверхности головного мозга и их последующего разрезания на кольца толщиной 8 микрон с помощью криостата. Поперечные срезы фиксируют на предметных стеклах и инкубируют с первичными антителами к рецептору эстрогена альфа.

Затем срезы инкубируют с вторичными антителами и контрастным красителем, используя среду для заключения, содержащую dpi. В завершение сегменты сосудов кожуры с флуоресцентной меткой визуализируют и преобразуют в 2D-изображения с помощью программного обеспечения для расширенного фокуса по глубине. В конечном итоге, используя иммунофлуоресцентный микроскоп Nikon с программным обеспечением для расширенного фокуса, можно получить результаты, демонстрирующие экспрессию рецептора эстрогена альфа в артериолах кожуры.

Меня зовут доктор Маргерит Литтлтон Кирни. Сегодня доктор Нил Фарани, постдокторант моей лаборатории, продемонстрирует простую процедуру по оптимизации визуализации и окрашивания рецептора эстрогена альфа в эпителии.

Артерии мозга крысы, который был перфузирован красителем Эванса и хранился при температуре -70 °C. С помощью диссекционного микроскопа идентифицируйте поверхностные артерии на поверхности мозга и извлеките их, используя тонкий пинцет. Осторожно удалите любые прилипшие фрагменты тканей мозга.

Поместите артерии в небольшую пробирку на льду. Фиксируйте артерии в 2% холодном порошкообразном формальдегиде в 0.1 моле PBS в течение 30 минут. Чтобы подготовить артерии к секционированию, налейте среду для заливки на замораживающий диск, установленный на температуру -20 °C.

Положите участок артерии на плоскую поверхность чашки и дождитесь ее замерзания. После того как образец плотно замерзнет, установите артерию вертикально в среду для заливки на замораживающем диске криостата. Убедитесь, что кончик артерии направлен вперед.

Удерживайте артерию пинцетом до ее полного замораживания. Поместите замораживающий диск с артерией в головку криостата, затем нарежьте срезы артериальных колец толщиной 8 микрон непосредственно на предметное стекло. Закрепите срезы артерии на хромокалиевом желатине.

Расположите препараты на предметных стеклах, используя две кисти для выравнивания артериальных колец. Храните подготовленные стекла в контейнере для предметных стекол в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи. Извлеките стекла из холодильника и выдержите их при комнатной температуре на лабораторном столе.

Промойте предметные стекла 1–1,5 миллилитрами 0,1 М PBS. Через 10 минут слейте PBS и повторите процедуру еще дважды. После финальной промывки PBS инкубируйте предметные стекла в одном миллилитре 50 мМ хлорида аммония в течение 30 минут при комнатной температуре. Чтобы снизить уровень эндогенной флуоресценции, промойте предметные стекла в 0,1 М PBS 3 раза по 10 минут, как описано ранее. Затем заблокируйте предметные стекла в растворе PBS, содержащем 0,1% Triton X 100 и 1% нормальной козьей сыворотки, в течение 30 минут для снижения неспецифического связывания первичных антител.

После блокировки инкубируйте предметные стекла с первичными антителами к ER alpha, разведенными в блокирующем растворе в соотношении 1:500, в течение ночи при температуре 4 °C. Извлеките стекла из холодильника и доведите их до комнатной температуры. Отмойте несвязавшиеся первичные антитела, используя 1–1,5 мл 0,1% PBS, промывая 3 раза по 10 минут.

В каждом случае инкубируйте предметные стекла с вторичными антителами Oregon Green, 4 88 против кролика в блокирующем растворе в течение двух часов в темноте при комнатной температуре; после инкубации промойте стекла в 0,1 молярном PB S 3 раза по 10 минут на каждую промывку, а затем перенесите их в вытяжной шкаф. Нанесите каплю среды для заключения, содержащей dappy, на образцы, после чего накройте образец покровным стеклом. Нанесите бесцветный лак для ногтей, чтобы загерметизировать края покровного стекла, и дайте ему полностью высохнуть.

Поместите подготовленные предметные стекла с окрашенными сегментами сосудов эпидермиса под микроскоп и настройте прибор для визуализации флуоресцентно меченых исследуемых областей. Визуализация окрашенного ER alpha является самым сложным этапом данной процедуры. Найдите плоскость среза сосуда с наиболее четко выраженными рецепторами.

Начните с 100-кратного увеличения, затем увеличьте его до 600 крат. С помощью камеры зафиксируйте изображения в каналах DPI и ZI соответственно для ядер клеток и ER alpha, после чего с помощью программного обеспечения преобразуйте несколько проекций сегментов сосудов в 2D-изображения. Здесь представлены результаты иммунофлуоресцентного окрашивания на ER alpha (зеленый цвет) и контрастного окрашивания DPI.

На снимке кольца вырезанной артерии, изолированной из мозга самки крысы, совмещенные изображения (выделено синим) указывают на наличие внутриядерных рецепторов эстрогена альфа. С помощью комбинации Z-стеков можно получить сфокусированное изображение иммунофлуоресценции ER alpha; для учета автофлуоресценции следует выполнить отрицательный контроль как для первичных, так и для вторичных антител. Обратите внимание на выраженную автофлуоресценцию вдоль эндотелиальной стороны артерии, которая не инкубировалась с вторичными антителами.

После просмотра данного видео вы должны освоить методы изоляции и отделения артерий от поверхности головного мозга, а также технику подготовки поперечных срезов колец толщиной 8 мкм. Кроме того, вы должны ознакомиться с использованием флуоресцентно меченных рецепторов эстрогена альфа и методами визуализации этих рецепторов с помощью цифрового иммунофлуоресцентного микроскопа и соответствующего программного обеспечения Nikon.