Простой протокол Chelex для выделения ДНК из
9 января 2013 г.
Быстрый и доступный способ извлечения паразита малярии качества и векторной ДНК из образцов комаров описано. Опираясь на свойства хелатирующие смолы Chelex, простой метод позволяет генотипирования малярийных паразитов в комара средней кишки и слюнных желез фаз, а также молекулярная идентификация Anopheles Видов-двойников с помощью ПЦР.
Общая цель данной процедуры заключается в экстракции ДНК малярийного плазмодия, паразита и комара из отделов средней кишки и слюнных желез исследуемых образцов. Это достигается путем предварительного разрезания комара точно в месте соединения брюшка и груди, что позволяет отделить среднюю кишку от отдела слюнных желез. Затем каждый отдел растирают по отдельности в деионизированной воде.
Затем суспензию ткани подвергают щелочной обработке и промывке, после чего осаждают клетки. В завершение осадок клеток реконструируют и кипятят для экстракции ДНК. В конечном итоге можно получить высококачественную ДНК комара и малярийного паразита, подходящую для использования в качестве матрицы для выявления аномалий, определения видов переносчиков и генотипирования малярийных инфекций с помощью ПЦР и рестрикционного анализа с использованием аллель-специфичных ферментов.
Основным преимуществом этого крайне простого метода перед существующими, такими как органическая экстракция и методы сортировки, является использование минимального количества безопасных и доступных реагентов, а также значительно меньшее время обработки. Для начала препарирования комара поместите его на небольшой кусочек параформы и установите под диссекционный микроскоп. Покройте его каплей деионизированной воды.
Для размягчения тканей в фиксирующем растворе сделайте надрез туловища комара точно в месте соединения груди и брюшка. Таким образом отделите голову и грудь от брюшной части. Перенесите каждую диссекированную часть комара в чистую стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, предварительно промаркированную идентификационным номером комара и указанием части тела. Удалите парафильм и с помощью салфетки Kimwipe, смоченной в 70% спирте, тщательно протрите предметный столик микроскопа перед переходом к следующему комару. Для экстракции ДНК комара сначала внесите пипеткой 20 микролитров деионизированной воды в пробирку с образцом.
Затем с помощью наконечника дозатора разотрите погруженный сегмент комара до получения однородной суспензии. Добавьте к гомогенату образца 100 µL автоклавированного 1% раствора сапонина в XPBS и осторожно перемешайте на вортексе. Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 20 минут.
Затем центрифугируйте при 20 000 G в течение двух минут и удалите супернатант. Ресуспендируйте осадок в 100 мкл 1x PBS. Затем повторите центрифугирование.
Добавьте 75 µL стерильной деионизированной воды и 25 µL 20% (масса/объем) суспензии смолы Cellex 100 в деионизированной воде, затем осторожно перемешайте на вортексе для ресуспендирования осадка, используя стерильную гиподермическую иглу 23G, простерилизованную в пламени горелки Бунзена. Проколите отверстие в крышке пробирки с образцом.
Кипятите суспензию образца в нагревательном блоке в течение 10 минут. Центрифугируйте при 20, 000 G в течение одной минуты, после чего перенесите раствор ДНК в предварительно маркированную пробирку для хранения для использования в качестве матрицы в ПЦР-реакциях с целью проверки качества экстрагированной ДНК и амплификации участка гена митохондриальной никотинамидадениндинуклеотид-дегидрогеназы, субъединицы four членистоногого, что должно привести к получению фрагмента размером 400 base pair. Затем, для дифференциации видов Ananais Gambia, амплифицируйте участок, фланкирующий SNP в межгенном спейсере, что должно привести к получению фрагментов размером 390 base pair для Ananais Gambia Sens Stricto и 315 base pair для ananais api.
Затем проведите генотипирование полиморфизмов резистентности *P. falciparum* к антифолатам. Выполните вложенную ПЦР для амплификации области, прилегающей к кодонам аминокислот 16, 51, 59, 108 и 164 в гене дигидрофолатредуктазы паразита. Проведите аллель-специфическое рестрикционное расщепление ампликона для выявления резистентности к антифолатным препаратам.
Связанные полиморфизмы. Проверьте реакции с помощью электрофореза в 2% agarose геле. Примеры результатов ПЦР-анализа качества экстракта ДНК комаров, молекулярной идентификации RABIS и генотипирования p falciparum показывают, что упрощенный метод Kelex дает результаты, аналогичные стандартному протоколу высаливания, несмотря на меньшее количество этапов и сокращение времени выполнения более чем в четыре раза при сопоставимом качестве ДНК в соответствующих экстрактах. Неудивительно, что показатели положительных проб в отношении аномалий, сестринских видов Gambia, а также уровень инфицирования паразитами не имели статистически значимых различий согласно критерию хи-квадрат Макнира.
Добавление BSA в реакционные смеси приводит к общему увеличению количества положительных результатов ПЦР за счет удаления ингибиторов ПЦР как для упрощенного протокола с использованием kelex, так и для стандартного протокола высаливания. Однако этот рост не был статистически значимым, за исключением качества ДНК в экстрактах kelex. После освоения метода рестрикция ампликона p falciparum аллель-специфическими рестрикционными энзимами позволяет проводить генотипирование инфекций малярии в средней кишке и слюнных железах на наличие аллелей лекарственной устойчивости.
При правильном выполнении данная методика должна занять около 37 минут.
Обзор
В данной статье описывается быстрый и доступный метод выделения высококачественной ДНК из паразитов малярии и комаров-переносчиков. Благодаря использованию смолы Chelex данный метод позволяет эффективно проводить генотипирование паразитов малярии и молекулярную идентификацию видов Anopheles.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Геномика
Теоретические сведения
- Малярия представляет собой серьезную глобальную проблему здравоохранения; переносчиком заболевания являются комары Anopheles.
- Традиционные методы экстракции ДНК могут быть трудоемкими и требовать использования опасных реагентов.
- Существует потребность в более простых, безопасных и эффективных методах экстракции ДНК.
- В данном исследовании представлен метод, отвечающий этим требованиям, с использованием смолы Chelex.
Цель исследования
- Разработать быстрый и экономичный метод экстракции ДНК из паразитов малярии и комаров-переносчиков.
- Обеспечить возможность генотипирования паразитов малярии и идентификации видов Anopheles.
- Сравнить эффективность и результативность нового метода с традиционными протоколами.
Используемые методы
- Диссекция образцов комаров для отделения отделов средней кишки и слюнных желез.
- Измельчение тканей в деионизированной воде для получения суспензии.
- Использование смолы Chelex для экстракции ДНК.
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для генотипирования и идентификации видов.
Основные результаты
- Метод Chelex позволяет получить высококачественную ДНК, пригодную для ПЦР.
- Результаты сопоставимы с традиционными методами, при этом время обработки значительно сокращено.
- Показатели положительных проб при идентификации видов и выявлении паразитарных инфекций были статистически схожими для обоих методов.
- Добавление BSA улучшило результаты ПЦР за счет снижения влияния ингибиторов.
Выводы
- Упрощенный метод Chelex эффективен для выделения ДНК из переносчиков малярии.
- Данная методика может быть выполнена менее чем за 40 минут, что делает ее практичной для рутинного использования.
- Она представляет собой более безопасную и эффективную альтернативу традиционным методам выделения ДНК.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
В условиях ограниченных ресурсов для устойчивого молекулярного надзора за переносчиками и паразитами малярии требуются методы экстракции ДНК, в которых эффективность сочетается с операционной простотой. Протокол на основе Chelex обеспечивает качество ДНК, сопоставимое с установленными методами высаливания, при этом сокращая сложность реагентов и время обработки с почти трех часов до менее чем 40 минут. Это делает данный метод практическим инструментом для обеспечения масштабируемых и экономически эффективных рабочих процессов генотипирования и идентификации видов в рамках исследовательских и контрольных программ в эндемичных регионах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать взаимодействия между переносчиком и паразитом, предоставляя матрицы ДНК для подтверждения вида и оценки статуса инфицирования.
- Практическая ценность: сокращает время активной работы и расход реагентов, обеспечивая более высокую пропускную способность при обработке образцов, собранных в полевых условиях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать ДНК, подходящую для проведения ПЦР-анализов, направленных на дифференциацию видов переносчиков и генотипирование паразитов.
- Практическая ценность: Используются всего три реагента (деионизированная вода, сапонин, смола Chelex), что способствует стандартизации анализа и снижает вариабельность результатов в лабораториях с ограниченными ресурсами.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает преемственность этапов от сбора переносчиков до последующего применения, такого как генотипирование лекарственной устойчивости с помощью вложенной ПЦР и рестрикционного анализа.
- Практическая ценность: исключает необходимость использования опасных органических растворителей, что повышает безопасность и доступность метода в полевых лабораториях.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в общий процесс исследований — от обработки образцов до генетического анализа, обеспечивая надежный исходный материал для идентификации на основе ПЦР и проведения генотипирования.
- Открывательная биология: Облегчает проверку гипотез о распределении видов переносчиков и уровне инфицирования Plasmodium falciparum в полевых условиях.
- Скрининг: Позволяет получать экстракты ДНК достаточного качества и выхода для применения мультиплексной ПЦР, обеспечивая готовность анализа.
- Аналитика: Обеспечивает количественную оценку посредством ПЦР-амплификации ND4, видоспецифичных SNP и локусов лекарственной устойчивости, что позволяет проводить сравнение между группами образцов.
- Трансляционные исследования: Связывает энтомологический мониторинг с генотипированием паразитов, поддерживая принятие обоснованных с учетом рисков решений в стратегиях борьбы с малярией.
- Применение в масштабах предприятия: Простота протокола и минимальные требования к оборудованию (микроцентрифуга, нагревательный блок) позволяют внедрить метод на нескольких полевых участках и в различных исследовательских группах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает уверенность в прогнозировании при идентификации видов переносчиков и обнаружении паразитов благодаря чувствительности и специфичности, сопоставимым с эталонными методами.
- Операционная ценность: обеспечивает высокую воспроизводимость при минимальной зависимости от реагентов, что снижает уязвимость цепочки поставок в отдаленных районах.
- Стратегическая ценность: позволяет быстрее принимать решения о продолжении или прекращении действий в программах эпиднадзора за счет сокращения времени получения результатов молекулярного подтверждения.
- Влияние на портфель проектов: способствует приоритизации мероприятий с учетом рисков за счет предоставления своевременных и точных данных о компетентности переносчиков и распространенности паразитов.
Особенности реализации
- Требуется базовая подготовка в области молекулярной биологии для проведения диссекции тканей, гомогенизации и постановки ПЦР.
- Необходим доступ к микроцентрифуге, способной развивать ускорение 20,000 × g, и к нагревательному блоку для этапа кипячения.
- Для обеспечения стандартизации между группами исследователей рекомендуется использовать единообразные методы вортексирования и пипетирования при гомогенизации и ресуспендировании смолы.
- При адаптации метода для других видов комаров или типов образцов может потребоваться проверка эффективности лизиса и удаления ингибиторов.
- Практическое ограничение: метод включает этап ручного растирания, что без модификации может ограничить сверхвысокопроизводительную автоматизацию.
