Построение и недорогие лазерные Axotomy система по изучению Axon Регенерация в С. Элеганс

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать, как собрать и юстировать систему лазерной абляции для изучения регенерации аксонов в ганглиях заднего корешка (CL gans). Для этого сначала на оптическом столе монтируются лазерный блок, поляризатор Томпсона, полуволновая пластинка, поворотное зеркало, перископ, направляющая и зеркало на направляющей. Следующим этапом процедуры является совмещение лазерного луча с исходящим лучом из конденсорного объектива микроскопа.

Затем устанавливают, выравнивают и позиционируют линзу расширителя лазерного луча так, чтобы центрировать луч и сделать его с нулевой расходимостью. Заключительным этапом процедуры является совмещение пятна лазерной абляции с фокусом изображения путем проведения точной настройки. В конечном итоге, даже при несовершенном выравнивании по осям XY NC, использование дифракционно-ограниченного лазерного луча позволяет точно пересекать аксоны толщиной в полмикрона с минимальным сопутствующим повреждением тканей.

Главное преимущество данного метода перед существующими способами, такими как использование фемтосекундных лазеров, заключается в его относительной недорогости (15 000). Он практически не требует технического обслуживания и обеспечивает очень точное пересечение аксонов. Хотя этот метод позволяет изучить регенерацию аксонов у C. elegans, его также можно применять к другим системам, таким как мухи, данио-рерио, мыши, периферическая нервная система и культуры клеток in vitro.

По сути, любая клетка, находящаяся в пределах от 30 до 50 мкм от поверхности. Начните с размещения компонентов на оптическом столе, затем закрепите болтами стойку лазерного перископа и приподнятые направляющие опоры. В данной системе используется лазер класса 3B, который может вызвать серьезные повреждения глаз, поэтому строго соблюдайте правила техники безопасности при работе с лазером.

Проконсультируйтесь с сотрудниками вашей кафедры физики по вопросам безопасной работы со свободными пучками лазеров. Во время процесса юстировки всегда устанавливайте лазер на минимальную мощность. Перед тем как смотреть в окуляры, убедитесь, что лазер закрыт механическим затвором и выключен.

Теперь установите микроскоп: сначала совместите его с осью рельса. Затем совместите его с пучком проходящего света от конденсора микроскопа. В third-ий очереди совместите оба конца рельса с пучком конденсора, используя регулируемую апертуру или линзу, закрепленную на рельсе.

Перед продолжением используйте уровень и лабораторные домкраты для регулировки высоты направляющей. Убедитесь, что оба конца направляющей выровнены. Теперь проверьте, чтобы лазерный луч проходил через гланду, поляризатор Томпсона и полуволновую пластинку и не задевал их края при вращении.

С помощью нейтрального фильтра (halfway plate) отрегулируйте мощность лазера после того, как все компоненты будут закреплены на оптическом столе. Включите лазер, установите частоту импульсов на 100 в режиме непрерывного излучения и с помощью нейтрального фильтра снизьте мощность до минимума. Для визуализации лазерного луча используйте стикер или специальную бумагу для линз.

Теперь нужно поднять лазерный луч с оптического стола. Последовательно отрегулируйте и зафиксируйте кинематически закрепленные зеркала, начиная от лазера, чтобы направить луч к зеркалу, установленному на конце приподнятой направляющей. По завершении лазерный луч должен быть примерно центрирован относительно зеркал, а сами зеркала должны быть ориентированы примерно под углом 45 градусов к оси лазерного луча перед его совмещением с пучком прошедшего света микроскопа.

Снимите или откройте все ND-фильтры и диафрагмы в промежуточном модуле. Теперь мы переходим к самому важному этапу — обеспечению точного разрезания аксонов без избыточного сопутствующего повреждения. Мы проведем точную юстировку лазера по осям x, y и z при минимальной мощности лазера, чтобы получить минимальный размер пятна абляции.

Лазерный луч и прошедший свет будут видны одновременно на бумаге. Для начала расположите бумагу рядом с портом микроскопа. Теперь приступите к юстировке лазера, используя грубые настройки зеркала в верхней части перископа и зеркала на конце направляющей.

Поместите лист бумаги между выровненной линзой конденсора и открытой револьверной головкой объективов. Продолжайте использовать винты точной настройки на рельсовом зеркале, чтобы совместить лазерный луч с центром более широкого пучка проходящего света. После этого зафиксируйте микроскоп с помощью зажимов.

Дополнительные этапы по оценке юстировки лазера приведены в рукописи статьи. Для расширения лазерного луча диаметром 300 микрон в 33 раза с целью заполнения задней апертуры 10-миллиметрового объектива необходимо установить двойные галилеевы расширители пучка. Начните с установки четырех линз в держатели.

Затем закрепите линзы на направляющей так, чтобы они все находились на одной оптической оси и были строго перпендикулярны лазерному лучу. Включите лазер, установите минимальную мощность и режим непрерывного излучения. Выполните грубую юстировку луча при прохождении через каждую линзу.

Используйте лист бумаги, чтобы увидеть луч. Теперь выключите лазер. Установите защитную шторку на лазер и уберите микроскоп с пути лазерного луча.

Снова включите лазер и визуализируйте луч на ближайшей стене. Используйте точную настройку линз для расширения пучка. Затем отрегулируйте два последних кинематически закрепленных зеркала, чтобы направить луч так, чтобы он образовал круг равномерной яркости в предполагаемом положении задней апертуры объектива.

Оцените размер и однородность пучка на бумаге. Затем добейтесь нулевой конвергенции пучка, наблюдая за тем, как изменяется его размер при удалении бумаги от линзы. Выключите лазер и закройте механический затвор.

Сдвиньте микроскоп обратно в траекторию лазерного луча, используя фиксирующие зажимы для обеспечения правильного выравнивания. Установите зажимы на свободной стороне микроскопа, но не затягивайте их. Теперь включите лазер.

Уберите защитную заслонку и поверните револьвер объективов в открытое положение; при наличии бумаги на предметном столике должен быть виден расширенный и однородный лазерный луч, центрированный относительно пучка проходящего света от конденсатора. Если лучи не центрированы, выполните центровку, ослабив зажимы микроскопа и осторожно сдвинув его. Теперь закройте защитную заслонку и переведите лазер в режим триггера.

Поверните объектив с 60-кратным увеличением на месте. Теперь получите изображение поверхностных царапин на предметном стекле-мишени. Снимите защитную шторку, активируйте абляционный лазер и отрегулируйте мощность лазера для получения минимального пятна абляции.

Пятно должно быть круглым и находиться в пределах от 5 до 10 мкм от центра изображения — центра пятна абляции. С помощью точной регулировки зеркала на кинематической направляющей, чтобы сохранить центрирование пятна и однородность профиля луча, потребуется итерационная настройка зеркала на направляющей и верхнего зеркала перископа. Оцените Z-фокус лазера, систематически перемещая фокус вверх и вниз с шагом в 1 мкм, активируя абляционный лазер на каждом этапе.

Если пучок правильно расширен, выровнен и имеет правильно настроенную конвергенцию, то максимальная абляция должна происходить в фокусе изображения, при этом она должна быть слабой или отсутствовать на расстоянии одного микрона выше или ниже фокуса. Если точка максимальной абляции находится выше или ниже фокуса изображения, необходимо выполнить окончательную настройку Z-фокуса расширенного пучка, перемещая линзу L3 Галилеевского телескопа до тех пор, пока лазерная абляция не совпадет с фокусом изображения. Нематоды были закреплены на специально изготовленном предметном стекле, после чего была проведена абляция аксонов с использованием сконструированной системы Laser exo somy; при этом таймлапс-визуализация регенерации аксонов была очень эффективной.

С помощью моторизованного предметного столика удалось регулярно и точно рассекать и визуализировать пять аксонов от пяти разных животных на одном предметном стекле. Лимитирующим фактором было время визуализации аксонов.

Примерно в 10% экспериментов были получены высококачественные таймлапс-видео. Остальные эксперименты также обеспечили хорошие данные, однако были менее эстетичны из-за небольших дрожащих движений червя, которые обычно начинались спустя пять-восемь часов иммобилизации. При выполнении этой процедуры крайне важно точно оценивать юстировку лазера по осям x, y и Z.

Наиболее распространенной проблемой при попытке перерезать аксон являются сопутствующие повреждения или полная невозможность перерезать аксоны, и почти всегда это происходит из-за неправильной настройки лазера. Данная система лазерной абляции и метод визуализации регенерации аксонов в c Agains позволят вам регулярно оценивать влияние любой генетической мутации на регенерацию аксонов. NCL Agains.