Построение коллагена Гидрогель для доставки стволовых клеток, загруженных Хитозан микросфер

В данном протоколе представлена стратегия in vitro по доставке стволовых клеток из хитозановых микросфер в коллагеновый гелевый скаффолд с последующим сбором и культивированием. Первичные стволовые клетки адипоцитов подвергаются эмульгированию и восстанавливаются в препарате хитозановых микросфер. Затем стволовые клетки высевают на хитозановые микросферы и культивируют в inserts для культуральных планшетов с мембраной с размером пор 8 мкм для получения CSM, нагруженных CS; в завершение систему доставки на основе микросфер смешивают с трехмерным коллагеновым гелевым скаффолдом.

В конечном счете, данная система CSM обладает потенциалом для применения в регенеративной медицине и доставке лекарственных веществ. Основным преимуществом этого метода перед существующими подходами, такими как инъекции клеток или микроинкапсуляция, является способность клеток прикрепляться к материалу-носителю и сохраняться после первоначального введения. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, могут столкнуться с трудностями, так как микросферы из esan обладают внутренним статическим зарядом.

Загрузка клеток поверх слоя микросфер будет затруднительна без их повреждения. Вырежьте и промойте промежностную и эпидермальную жировую ткань из обертки, измельчите ткань, затем перенесите один-два грамма в 25 миллилитров HBSS, содержащего 1% FBS. После центрифугирования соберите слой свободно плавающей жировой ткани в колбу Эрленмейера объемом 125 миллилитров.

Добавьте 25 миллилитров коллагеназы второго типа и инкубируйте смесь на орбитальном шейкере. Затем осторожно удалите жидкую фракцию, находящуюся под слоем масла и жировой ткани, и последовательно профильтруйте ее через нейлоновые фильтры с размером пор 170 микрон. Соберите клетки путем центрифугирования после двух промывок 25 миллилитрами.

Для ресуспендирования в HBSS суспендируйте осадок в 30 миллилитрах дополненной среды для роста мезенхимальных клеток. Распределите очищенные стволовые клетки, полученные из жировой ткани, по двум культуральным колбам T 75 и амплифицируйте препарат A SC в увлажненном инкубаторе при 37 °C с содержанием 5% углекислого газа. Данный протокол CSM представляет собой процесс эмульгирования «вода в масле», в котором используется ионная техника коэруции.

Эмульгируйте 6 мл водного раствора хитозана в 100 мл смеси масляной фазы, используя одновременно верхнюю и магнитную мешалки, вращающиеся в противоположных направлениях, в течение одного часа до образования стабильной эмульсии воды и масла; каждые 15 минут в течение четырех часов добавляйте по 1,5 мл 1% раствора гидроксида калия в н-октаноле. По завершении реакции ионного сшивания медленно слейте масляную фазу и немедленно перенесите сферы в 100 мл ацетона. Промывайте сферы ацетоном до полного удаления масляной фазы.

Затем высушите полученные сферы в вакууме. С помощью анализатора размера частиц определите средний размер частиц CSM, площадь поверхности на миллиграмм и удельный объем. Промойте CSM трижды стерильной водой для удаления остаточных солей.

Теперь стерилизуйте приготовленный CSM абсолютным спиртом для использования в экспериментах с клетками. В стеклянной пробирке объемом 50 мл смешайте 5 мг микросфер с 1 мл 0,5% раствора TNBS и инкубируйте в течение четырех часов при 40 °C. Затем добавьте 3 мл 6 N соляной кислоты и инкубируйте при 60 °C в течение двух часов. После охлаждения образцов до комнатной температуры добавьте 5 мл деионизированной воды и 10 мл этилового эфира.

Для экстракции свободного TNBS отберите аликвоту водной фазы объемом 5 мл и выдержите ее в водяной бане при температуре 40 °C в течение 15 минут для испарения остатков эфира, после чего охладите до комнатной температуры. Разбавьте образец 15 мл воды и измерьте с помощью спектрофотометра оптическую плотность подготовленных микросфер хитозана при 345 нм, используя TNBS в качестве холостой пробы.

Также измерьте массу хитозана, использованного для приготовления CSM. Затем рассчитайте количество свободных аминогрупп CSM относительно общего количества аминогрупп в хитозане. Инкубируйте пять миллиграммов стерильного CSM в стерильном HBSS в течение ночи для достижения равновесия.

Перенесите CSM на мембранный вкладыш с порами 8 мкм для 24-луночных культуральных планшетов. После того как CSM осядут, осторожно аспирируйте HBSS. Затем добавьте 300 µL ростовой среды внутрь вкладыша и 700 µL ростовой среды снаружи вкладыша. Resus.

Суспендируйте стволовые клетки, полученные из жировой ткани, в 200 µL ростовой среды и посейте их поверх CSM в культуральной чашке. Инкубируйте в течение 24 часов в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% carbon dioxide. Перенесите CSM, загруженный стволовыми клетками, в стерильную микроцентрифужную пробирку, стараясь не потревожить клетки, мигрировавшие в мембрану вставки.

Теперь удалите остатки среды и добавьте в каждую пробирку 250 µL свежей ростовой среды. Добавьте 25 µL раствора MTT с концентрацией 5 mg/mL и инкубируйте в течение четырех часов. Удалите среду и добавьте 250 µL диметилсульфоксида, перемешав на вортексе для растворения образовавшегося комплекса; центрифугируйте CSM при 2 700 ×g в течение пяти минут.

Измерьте оптическую плотность супернатанта при 570 нанометрах, используя 630 нанометров в качестве референса. Определите количество клеток, связанных с CSM, относительно значения оптической плотности, полученного для известных количеств жизнеспособных A SC. Смешайте пять миллиграммов CSM, нагруженного A SC, с 7,5 миллиграммами на миллилитр коллагена I типа, экстрагированного из крыс.

Доведите pH сухожилия хвоста до 6.8 с помощью 2N гидроксида натрия и перелейте в чашку для культивирования. Вставьте для фибрилляции, затем перенесите в 12-луночный планшет и инкубируйте в течение 30 минут. Продолжайте обновлять среду для гелей коллагена A-S-C-C-S-M через день на протяжении всего периода инкубации.

Также с помощью стандартных методов микроскопии контролируйте выход и миграцию клеток из CSM в гель. В следующем примере описывается стратегия in vitro по доставке стволовых клеток, полученных из жировой ткани, из хитозановых микросфер в коллагеновый гель-скаффолд. Снимки СЭМ и ПЭМ подтверждают получение пористых CSM однородного размера.

Инкубация микросфер с первичными стволовыми клетками, полученными из жировой ткани, показала наличие 4 000 клеток на миллиграмм CSM calcium am. Окрашивание одной SC демонстрирует распластывание по поверхности CSM с проникновением филоподий в пористые полости микросферы. При смешивании CSM с нагруженными клетками и коллагенового геля клетки мигрируют в гель, что позволяет отслеживать их перемещение с течением времени.

Практическое применение данного метода может быть незамедлительно расширено на терапию массивной и хронической потери тканей. Более того, этот режим лечения обладает значительно большим потенциалом благодаря своей универсальности, позволяющей интегрировать различные типы клеток и/или биоматериалов для лечения различных степеней повреждения мягких тканей и тканей сердца. Предполагается, что данный метод может дать представление о доставке собственных клеток организма.

Данный метод также может быть применен к другим системам, таким как инъекционные препараты, для доставки терапевтических лекарственных средств или разработки гибридных систем для одновременной доставки как клеток, так и терапевтических препаратов.