Мультиплекс Обнаружение бактерий в сложных клинических и экологических пробах с использованием олигонуклеотидных связью Флуоресцентные Микросферы

Здравствуйте, меня зовут Тим Дусо, я представляю Министерство сельского хозяйства и продовольствия Канады (Agriculture and AgriFood Canada). В этом видео мы продемонстрируем протокол определения наличия и количественного содержания специфических микроорганизмов в сложном клиническом или экологическом образце с использованием прибора Bio-Plex. В данном протоколе используются флуоресцентные полистирольные микросферы, химически связанные со специфическим олигонуклеотидным зондом для данного вида.

Из образца с помощью универсальных ПЦР-праймеров генерируется ампликон, который затем гибридизуется с микросферами, конъюгированными с зондом. Прибор Bio-Plex регистрирует два сигнала: один идентифицирует микросферу, а другой количественно определяет сигнал гибридизации.

Общая цель данной процедуры заключается в быстром и полуколичественном определении профиля интересующей микробиоты. Мы применили этот метод для анализа бактериальных профилей в мазках из влагалища и использовали полученные данные для диагностики бактериального вагиноза — клинического состояния, характеризующегося изменением микробиоты, при котором распространенность организмов рода Lactobacillus снижается, а в мазках из влагалища начинают обнаруживаться другие организмы, такие как Gardnerella, vais и apoian vae. Однако важно помнить, что данный метод может быть применен к любой другой микробиоте, для которой требуется экспресс-анализ с мультиплексным определением.

Начнем с описания принципа работы данной процедуры. Микробный профиль создается путем амплификации генов белка-шаперона GroEL всех организмов, присутствующих в экстракте ДНК со своба. Один из универсальных праймеров для амплификации модифицирован путем добавления биотина, а также включения оснований с фосфатной модификацией.

На 5'-конце ампликон делают одноцепочечным с помощью экзонуклеазы T7, которая деградирует только антисмысловую цепь. Поскольку смысловая цепь защищена фосфомодифицированным ПЦР-праймером, олигонуклеотидные зонды, комплементарные оставшейся цепи, ковалентно связываются с флуоресцентными полистирольными микросферами. Поскольку каждый уникальный цвет микросфер соответствует зонду, детектирующему определенный организм, для одного образца можно использовать до ста различных типов микросфер.

Одноцепочечный продукт ПЦР, полученный из вагинального мазка, гибридизуется со смесью бусин, конъюгированных с зондами ко всем интересующим организмам. Добавляется флуоресцентный репортер FICO ethin, который связывается с биотинилированными зондами через стрептавидиновый конъюгат. Наконец, смесь после гибридизации анализируется на приборе Luminex или Bio-Plex, который индивидуально определяет идентичность каждой бусины и сигнал гибридизации.

Результаты данного анализа указывают на присутствие специфических микроорганизмов, при этом интенсивность сигнала гибридизации коррелирует с численностью данного организма. В образце наличие организмов, связанных с бактериальным вагинозом (БВ), может быть использовано для диагностики БВ. Основным преимуществом этого метода перед существующими способами, такими как окраска по Граму, является получение информации о наличии конкретных микроорганизмов и их численности.

Процедуру продемонстрирует Дженнифер Таун, научный сотрудник нашей лаборатории. Ресуспендируйте микросферы, перемешивая их на вортексе в течение примерно 20 секунд. Перенесите 400 µL микросфер в центрифужную пробирку Эппендорфа и центрифугируйте при 14 000 ×g в течение одной минуты, затем удалите и утилизируйте супернатант. Ресуспендируйте микросферы в 50 µL 0.1 M MES pH 4.5.

Добавьте одну часть захватывающего олигонуклеотида к микросферам и перемешайте с помощью вортекса. Добавьте 2,5 µl свежего раствора EDC к микросферам. Инкубируйте реакционную смесь при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.

Утилизируйте раствор EDC, приготовленный ранее, и приготовьте свежий образец EDC в воде с концентрацией 10 mg/mL. Как и в предыдущем случае, добавьте к микросферам еще 2.5 µL свежего раствора EDC и перемешайте на вортексе в течение пяти секунд. Снова инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.

Промойте гранулы, добавив 1 mL 0,02% Tween 20; перемешайте на вортексе для ресуспендирования гранул, затем центрифугируйте при 14 000 ×g в течение одной минуты, после чего удалите и утилизируйте супернатант. Промойте гранулы повторно, добавив 1 mL 0,1% SDS. Ресуспендируйте гранулы в 100 µL ТЕ-буфера.

Подсчитайте количество микросфер в гемоцитометре для определения исходной концентрации. Приготовьте мастер-микс микросфер, разводя каждую микросферу до конечной концентрации 100 beads per microliter в буферном растворе; объедините микросферы в соответствии с требуемой мультиплексностью анализа. Храните мастер-микс микросфер при температуре 4 °C в темноте. При соблюдении этих условий данная смесь может храниться в течение нескольких месяцев. Получите ПЦР-продукт для каждого образца.

Сразу после завершения ПЦР добавьте набор праймеров на 5'-конец, модифицированных фосфатом и биотином. Добавьте по 2 µL T7-экзонуклеазы в каждую ПЦР-пробирку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 40 минут. По окончании инкубации добавьте в смесь 12,5 µL 0,5 M EDTA (pH 8,0).

В итоге получается около 64.5 µL одноцепочечного ПЦР-продукта. Ресуспендируйте мастер-микс Bend Microsphere с помощью пипетки. Перенесите необходимый объем в пробирку типа «эппендорф».

Закройте пробирку крышкой и обработайте в ультразвуковой водной бане в течение двух минут. Раздайте по 17 µL одноцепочечного ПЦР-продукта в соответствующие лунки низкопрофильного 96-луночного планшета, затем добавьте в каждую лунку по 33 µL суспензии обработанных ультразвуком магнитных частиц.

Накройте планшет силиконовым покрытием и слегка постучите по нему. Аккуратно поместите планшет в термоциклер с заданной программой: 95 °C в течение пяти минут, 60 °C в течение 10 минут, затем удержание или пауза при 60 °C в течение пяти минут. Завершите настройку и запустите программу.

Приготовьте свежий раствор strep Aden FICO Ethin. Вам потребуется 25 µL на лунку. Приготовьте strep и FICO ethin, разводя стоковый раствор до концентрации 1 mg/mL.

Разведите в соотношении от 1 к 50 до 20 мкг/мл в 1х буфере TMAC. Когда термоциклер достигнет этапа выдержки при 60 °C, откройте крышку, снимите силиконовую накладку и добавьте раствор strep din FICO ethin непосредственно в каждую лунку. Установите силиконовую накладку на место, закройте крышку термоциклера и возобновите программу.

По завершении программы извлеките планшет и быстро перенесите его в систему Bio-Plex для считывания. Считывание планшета должно быть выполнено в течение 10 минут. Считывание планшета проводится при температуре 60 °C.

Убедитесь, что система Bio-Plex была предварительно нагрета до этой температуры. Здесь представлены результаты соответствующего окрашивания по Граму и профили Luminex лонгитюдных образцов, полученных от одного индивидуума в момент времени ноль. Результаты окрашивания по Граму соответствуют клиническому диагнозу БВ, что подтверждается анализом Fiveplex Luminex, демонстрирующим положительные сигналы гибридизации для микроорганизмов, ассоциированных с БВ, включая Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae и Prevotella bivia.

Lactobacillus iners также обнаруживается на низком уровне по мере прохождения времени. Как показывают результаты окрашивания по Граму, у данного пациента происходит переход от микробиоты БВ к нормальной микробиоте. Анализ этих же образцов с помощью системы Luminex показывает, что численность Gardnerella vaginalis достигает пика, а затем снижается, в то время как количество lactobacillus iners растет, и к конечному моменту наблюдения данный организм становится доминирующим.

Использование данного метода профилирования микробиоты позволяет получить данные о наличии конкретных организмов, а также об их численности. Поскольку метод основан на секвенировании, разработка зондов может опираться на данные глубокого секвенирования, а микроорганизмы, идентифицированные методами секвенирования следующего поколения, могут отслеживаться в образцах быстрым и относительно недорогим способом. Просмотр этого видео должен был дать вам четкое понимание того, как создать микробный профиль образца с помощью прибора Luminex или Bio Plex.

Мы продемонстрировали вам, как конъюгировать олигонуклеотидные зонды с флуоресцентными микросферами, получать одноцепочечную алликону из клинического или экологического образца, проводить гибридизацию и определять результаты на приборе Luminex или Bio Plex. Желаем успехов в ваших экспериментах.