Обнаружение бактерий с помощью флуорогенных DNAzymes

Общая цель следующего эксперимента заключается в быстром обнаружении специфических бактерий, таких как e coli, с использованием новых флуорогенных ДНК-зимов (DNA Zyme probes). Сначала путем лигирования синтезируются геномные ДНК-зимы. Затем проводится культивирование бактерий для увеличения количества целевых молекул, после чего из супернатанта готовится соответствующая внеклеточная смесь.

Затем неочищенную смесь внеклеточных компонентов объединяют с ДНК-зимным зондом; взаимодействие между ДНК-зимным зондом и молекулами-мишенями приводит к расщеплению зонда, который затем начинает флуоресцировать. С помощью флуориметра взаимодействие между зондом и мишенью регистрируется как увеличение относительной флуоресценции. Результаты затем подтверждают с помощью анализа методом денатурирующего полиакриламидного гель-электрофореза.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с ПЦР или методами на основе антител является то, что процедура проще и легче в исполнении. Хотя этот метод был разработан на примере модельной бактерии e coli, он может быть применен для обнаружения любых других пищевых или нозокомиальных бактериальных патогенов. Как правило, люди, которые только начинают осваивать этот метод, могут столкнуться с трудностями, так как они могут быть не привычны к работе с синтетическими ДНК-зондами и бактериями. Демонстрацию данной процедуры проводят Серхио Агире, лаборант-исследователь моей лаборатории, и Монсо Али, постдокторант.

Основным ДНКзимом является R-F-D-E-C one. Он состоит из каталитической последовательности EC one, подчеркнутой черным цветом, и последовательности субстрата FS one, подчеркнутой зеленым цветом; в состав субстрата входит РНК-связь, обозначенная синей буквой r, фланкированная флуоресцентно-меченной DT, обозначенной буквой F, и гасителем (QUENCHER) в составе DT, обозначенным буквой queue. RF SS one представляет собой перетасованную версию RFD EEC one, в которой каталитическая последовательность EEC one частично перемешана с SS one, но часть FS one остается неизменной. RF DEC one и RF SS one создаются путем темплатного ферментативного лигирования олигонуклеотида FS one с олигонуклеотидом EC one или SS one в присутствии LT one в качестве темплата лигирования для подготовки сырых внеклеточных смесей (cems), которые будут использоваться в качестве мишени для R-F-D-E-C one. Начните с того, что с помощью автоматического дозатора внесите 2 мл LB в стерильные культуральные пробирки объемом 14 мл.

Затем, используя стерильный наконечник дозатора, возьмите одну колонию e coli с чашки с агаром и перенесите ее в культуральную пробирку с LB. Поместите пробирки в инкубатор, настроенный на 37 °C, и после начала инкубации встряхивайте при 250 RPM в течение 14 часов. Для получения 1% инокуляционной культуры разлейте 2 мл свежего LB в культуральные пробирки объемом 14 мл и добавьте 20 µL бактериальной культуры из предыдущего этапа.

Инкубируйте пробирки при 37 °C с перемешиванием при 250 об/мин до тех пор, пока OD 600 каждого бактериального раствора не достигнет примерно единицы. Перенесите 1 мл каждой культуры в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и осадите клетки центрифугированием при 11 000 G в течение пяти минут. После центрифугирования перенесите прозрачный супернатант в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Храните супернатант при температуре -20 °C. Если супернатант не будет использован незамедлительно для определения того, генерируется ли флуоресцентный сигнал при взаимодействии ферментов ДНК с неочищенным клеточным экстрактом, образцы анализируют методом спектрофотометрии. Включите флуоресцентный спектрофотометр и настройте параметры сбора данных: длина волны возбуждения 488 нм и длина волны эмиссии 520 нм.

Также настройте прибор для снятия показаний каждую минуту в течение одного часа. Промойте три кюветы из кварцевого стекла сначала дистиллированной деионизированной водой, а затем 100% ethanol. Высушите кюветы, обдув их азотом.

Маркируйте кюветы: C1 — для первого контроля, C2 — для второго контроля и T — для тестового образца. Затем перенесите 24 µL дистиллированной деионизированной воды в кювету C1 и по 24 µL подготовленной неочищенной смеси внеклеточных белков E. coli в кюветы C2 и T. Добавьте по 25 µL 2X RB в каждую кювету и поместите их во флуоресцентный спектрофотометр. Начните сбор данных флуоресценции; через пять минут добавьте 1 µL 5 µM RFS S1 в C2 и по 1 µL 5 µM RFD eec1 в T и C1, следя за тем, чтобы регистрация флуоресценции не прерывалась. Перемешайте каждый раствор путем пипетирования, затем дайте реакции протекать до конца периода сбора данных.

Сохраните данные в формате файла Excel. Затем перенесите данные на персональный компьютер и с помощью Excel создайте графическое изображение. Используйте те же реакционные смеси, которые применялись для анализа в программе Spectra.

Фотометрия может быть использована для анализа методом гель-электрофореза. По истечении одного часа сбора данных извлеките кюветы из спектрофотометра и перенесите растворы в новые микроцентрифужные пробирки.

Остановите реакции, добавив 5 µL 3 M ацетата натрия и 125 µL 100% этанола. Перемешайте каждый раствор с помощью вортекса и поместите пробирки в морозильник при температуре -20 °C на один час. После инкубации центрифугируйте реакционные смеси при 11 000 G в течение 20 минут при температуре 4 °C и аккуратно удалите супернатант с помощью пипетки.

Высушите осадки с помощью концентратора ДНК в течение 10 минут. Добавьте 20 µL буфера для нанесения геля и коротко перемешайте на вортексе. Коротко центрифугируйте в настольной центрифуге.

Затем внесите по 10 µL образцов реакции в каждую лунку 10% Dage-геля после завершения запуска. Снимите стеклянные пластины и тщательно промойте их проточной водой. Чтобы удалить остатки геля, протрите пластины салфеткой Kimwipe.

Просканируйте гель-планшет на наличие флуоресценции с помощью сканера Typhoon. Проанализируйте полученные изображения с использованием программного обеспечения для количественного анализа изображений, чтобы оценить чувствительность системы. Культуры с серийными разведениями выращивают в течение увеличивающихся промежутков времени.

Для определения минимального периода инкубации, необходимого для обнаружения одной бактерии, подготовьте 10 культуральных пробирок, содержащих по два миллилитра LB. Инокулируйте каждую культуру 100 µL глицеринового стока E. coli с концентрацией 2 CFU/mL и инкубируйте при 37 °C с перемешиванием при 250 RPM в течение 4, 8, 12, 16 и 24 часов. Отберите по 300 µL из каждой инокулированной культуральной пробирки, учитывая, что в образцах, отобранных в моменты времени 4, 8 и 12 часов, детектируемые бактерии могут отсутствовать.

Оставьте оставшуюся культуру расти в течение 24 часов, чтобы идентифицировать культуры, содержащие бактерии. Измерьте OD 600 и осадите клетки путем центрифугирования при 11,000 G в течение пяти минут. Перенесите супернатант, содержащий CEMS, в новые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра и храните при минус 20 °C до использования на следующий день.

Проверьте культуры на наличие роста. Только в одной или двух из 10 культур после инокуляции может содержаться e coli, в остальных пробирках клеток будет отсутствовать. Используйте CEMS, выделенные из положительных культур в установленные моменты времени, для проведения реакций расщепления с помощью RFD EEC one; проанализируйте реакционные смеси с помощью электрофореза в DAGE-геле, как описано ранее. Зонды RFD EEC one и RF SS one были получены путем ферментативного лигирования фрагментов ДНК-зима к субстрату.

Взаимодействие FS one с CEM EEC и RFD EEC one или RF SS one затем оценивали с помощью спектрометрии. Как видно здесь, RFD EC one при добавлении CEM ec давал высокий уровень флуоресцентного сигнала.

Напротив, R FS S one не produced сильного флуоресцентного сигнала. Таким образом, функция RFD EEC one по созданию флуоресценции при контакте с CEM EC подвергается секвенированию.

Для подтверждения того, что наблюдаемое увеличение флуоресценции было вызвано расщеплением РНК-связи, смеси реакций анализировали методом электрофореза. Ожидается, что расщепление RFD еec под действием 0,25 M гидроксида натрия приведет к образованию двух фрагментов РНК: фрагмента с 5'-концом, сохраняющего флуорофор, и фрагмента с 3'-концом, сохраняющего гаситель. Как видно здесь.

Реакционная смесь RFD EEC CEM EEC действительно дала ожидаемый продукт расщепления. Более того, только UNC расщепила R-F-D-E-C, и пятиштриховой фрагмент был обнаружен с помощью флуоресцентной визуализации. Чтобы проверить специфичность RFD EEC, были проведены флуоресцентные анализы с использованием CEMS, собранных исключительно из нескольких других грамотрицательных и грамположительных бактерий.

Образец, содержащий CEM EC, вызвал увеличение флуоресценции. Отсутствие перекрестной реактивности с CEMS других бактерий указывает на высокую селективность R-F-D-E-C one к e coli. Для определения минимального времени культивирования, необходимого для обнаружения одной клетки e coli, e coli развели до концентрации 1 CFU на миллилитр; 100 µL полученного раствора культивировали в ростовой среде в течение 4, 8, 12, 16 и 24 часов. Полученные CEMS смешивали с R-F-D-E-C one, а расщепление оценивали с помощью dage, как показано здесь.

Изображение анализа Dage показывает, что образец R-F-D-E-C один не привел к образованию ожидаемого продукта расщепления. При взаимодействии с CEM образцы ECS, собранные через четыре и восемь часов роста, указывают на то, что после освоения метода потребуется время культивирования 12 часов.

Ключевым компонентом данного метода является то, что при правильном выполнении ферментативный анализ ДНКаз может быть завершен за 60 минут после данной разработки. Эта процедура открыла исследователям в области биоанализа путь к изучению аллогенных ДНК-зимов для обнаружения широкого спектра бактериальных патогенов.