Визуализация Caenorhabditis Elegans Кутикулы структур с помощью липофильных Vital краска, DII

Общая цель данной процедуры заключается в визуализации кутикулы у живых прозрачных особей Caenorhabditis elegans с помощью красного флуоресцентного липофильного красителя Dye Eye. Для этого подготавливают популяцию нематод для окрашивания. Затем в популяцию добавляют разведенный краситель Dye Eye и инкубируют их.

Затем животных извлекают из красильного раствора. Флуоресцентная визуализация окрашенной кутикулы позволяет детально рассмотреть поверхность, включая репродуктивные структуры Ailey и Ann eye, а также другие внешние морфологические особенности. Основное преимущество данного метода перед существующими способами визуализации кутикулы у этого прозрачного организма, такими как прямая визуализация, флуоресценция, экспрессия трансгенов, окрашивание антителами, электронная микроскопия и использование меченого агглютинина зародышей пшеницы, заключается в том, что данный метод прост в исполнении, относительно быстр, недорогостоящ и обеспечивает высокое разрешение кутикулярных структур у живых животных.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы во многих областях, использующих модельную систему *C. elegans* и ее кутикулу, таких как секреция клеток и организация кутикулы, развитие эпидермальных клеток, гетерохронные генные пути, врожденный иммунитет, развитие морфологических признаков и эволюция нематод. Процедуру продемонстрирует Робби Шульц, аспирант моей лаборатории. При работе с красителем DiI помните, что он чувствителен к свету.

Всегда защищайте D eye от воздействия света, оборачивая его фольгой. Также используйте перчатки и лабораторный халат, так как DMF токсичен, а DAI является канцерогеном. Цианид Dai очень активен.

Стандартный рабочий раствор имеет концентрацию 30 µg/mL DII в M9; для одной популяции требуется всего 400 µL рабочего раствора. Начните с чашки диаметром 60 мм с популяцией неконтаминированных нематод. Смойте животных с чашки в 1.5 mL 0.5% Triton X 100.

В буфере M9 осторожно перемешайте жидкость круговыми движениями, чтобы высвободить всех личинок и взрослых особей, затем перенесите промывочный раствор в пробирку объемом 1,5 мл. Сразу же центрифугируйте животных при 2000 RRP M в течение 30 секунд, чтобы осадить их на дно пробирки. Удалите максимально возможное количество супернатанта, стараясь не потревожить осадок с животными.

Действуйте осторожно, не стремясь к избыточности. Промойте животных 1 mL M9. Центрифугируйте и удалите супернатант.

Повторите промывку. Снова центрифугируйте и удалите супернатант. Затем добавьте в пробирку 400 µL DAI в концентрации 30 µg/mL в буфере M9.

Кратковременно перемешайте содержимое пробирки на вортексе, чтобы ресуспендировать животных. Затем в горизонтальном положении в условиях защиты от света инкубируйте пробирку при температуре 20 °C в течение от 3 до 16 часов при 350 RPM. Соблюдение временных интервалов на этих этапах имеет важное значение.

Во-первых, необходимо вымыть Triton X, чтобы он не удалил липиды, с которыми связывается краситель. Во-вторых, животных следует выдерживать в растворе красителя достаточно долго для обеспечения равномерного окрашивания кутикулы. Затем животным дают время на восстановление на пище, чтобы удалить несвязанный краситель.

По завершении окрашивания центрифугируйте животных и удалите раствор красителя. Промойте животных одним миллилитром M nine. Для удаления несвязавшегося красителя центрифугируйте животных и удалите супернатант.

Перевзвесьте животных в 400 µL буфера M9 и перенесите их на свободный от бактерий участок микропланшета с NGM, засеянного E. coli штамма OP50. Дайте животным восстановиться в темноте в течение минимум 30 минут, но не более одного дня, так как флуоресценция красителя угасает во время восстановления. Животные должны уползти из жидкости с красителем на корм.

Эти животные легче поддаются визуализации, так как они обладают меньшей фоновой флуоресценцией от свободного красителя в глазах. Начните с подготовки агарного слоя на предметном стекле. Для обеспечения равномерной толщины используемого агарного слоя используйте две проставки.

Разделитель изготавливают, наклеив два слоя лабораторной ленты на предметное стекло. Разделители можно использовать многократно. Затем поместите чистое предметное стекло вдоль между двумя стеклами-разделителями и пипеткой внесите около 150 µL расплавленного четырехагара.

На центр чистого предметного стекла. Быстро накройте расплавленный AER дополнительным стеклом, помещенным перпендикулярно над AER и обоими спейсерами, чтобы сформировать агаровую подушечку. Осторожно снимите покровное стекло, удерживая подушечку по центру верхней части предметного стекла.

Теперь нанесите пипеткой 5 µL анестетика для нематод на предметное стекло, поместите 8–12 особей в анестетик и осторожно накройте покровным стеклом для микроскопа. Наблюдайте за животными с помощью светового или конфокального микроскопа, оснащенного объективом с увеличением не менее 40x и фильтром TRITC или другим совместимым фильтром. Максимум возбуждения флуоресценции красителя Dye I составляет 549 нм, а максимум эмиссии — 565 нм.

Для визуализации связанных красителей этап имиджинга является самым сложным в данном протоколе. Мы демонстрируем способ фиксации животных для визуализации, однако вам следует пройти соответствующее обучение работе с конкретным компаундом или конфокальным микроскопом, который вы будете использовать. По нашему опыту, для разрешения деталей, выявляемых методом окрашивания, лучше всего использовать объектив с увеличением не менее 60x.

Каждое из изображений в данном разделе было получено с использованием объектива 63x на постэмбриональной стадии развития C. elegans. Поверхность кутикулы разделена кольцевыми бороздами, а на некоторых стадиях присутствуют продольные гребни, называемые алейями. Каждое из изображений в данном разделе было получено с использованием объектива 63x на постэмбриональной стадии развития C. elegans.

Поверхность кутикулы содержит годовые кольца, разделенные кольцевыми бороздами, а на некоторых стадиях — продольными гребнями, называемыми алей. Каждая стадия развития характеризуется структурами кутикулы с различным составом и рисунком; гребни или борозды как алей, так и Aly флуоресцентно окрашиваются в зависимости от состава поверхности.

При использовании данного метода окрашивания на всех стадиях развития личинок и взрослых особей они остаются видимыми в течение одного дня после восстановления. Иногда наблюдаются фоновые флуоресцентные вкрапления, но не на постоянной основе. На данном изображении представлена кутикула взрослых мутантных животных с умеренными дефектами организации кутикулы.

Гребни Ailey имеют прерывистый и добавочный характер. Гребни Ailey слиты, разветвлены или бифуркированы, что является общим трансгенным маркером. Доминантный аллель roll six вызывает скручивание кутикулы, которое может наблюдаться в области ailey и приводить к неправильному расположению колец.

Dai также окрашивает другие внешние структуры кутикулы, включая взрослого гермафродита, вульву, а также поднятие хвоста и веер у взрослых самцов; dai также может выявить незначительные дефекты внешней морфологии, такие как этот раздвоенный хвост, при недостаточном окрашивании. Например, двухчасовое окрашивание приводит к неоднородному окрашиванию кутикулы, хотя нейроны, расположенные на поверхности, могут окраситься. После освоения этой методики, при правильном выполнении, процедура занимает четыре часа, не считая визуализации. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как окрашивать C. elegans красителем dai для наблюдения за кутикулой и другими внешними морфологическими структурами.