Простой метод для работы с изображениями Arabidopsis Листья Использование Perfluorodecalin как инфильтративный Средний изображений

Общая цель данной процедуры заключается в минимизации деградации биологических изображений, вызванной наличием воздушных пространств в листьях растений, для получения более четких снимков живых клеток внутри листа. Если лист закреплен в водной среде для заключения и флуорофор возбуждается лазером, многочисленные незаполненные воздушные полости и изменения показателя преломления внутри ткани, показанные оранжевым цветом, ограничивают интенсивность сигнала, исходящего из глубоких слоев ткани на итоговом изображении. Если же лист закреплен в перфтордекалине или PFD, лазерное возбуждение флуорофора затухает в меньшей степени, что обеспечивает лучшую передачу излучаемых сигналов.

В конечном итоге, использование сканирующей лазерной конфокальной микроскопии с монтажной средой PFD позволяет получать четкие изображения живых клеток внутри листа растения на глубине, более чем в два раза превышающей глубину, достижимую при использовании водных монтажных сред. Главным преимуществом этого метода перед существующими способами, такими как фиксация или монтирование листьев в водных средах, является снижение рефракции внутри мезофилла, что обеспечивает более точную визуализацию живых клеток в глубоких слоях листа, что ранее представляло проблему. Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов растительной науки, таких как изучение биологии клеток мезофилла и сигнализации in vivo, колонизация листьев патогенами и взаимодействия с патогенами, предоставляя тем самым новое понимание фундаментальной биологии растений.

Этот метод также может быть применен к другим тканям с высоким показателем преломления, содержащим большое количество воздушного пространства, таким как внутренние спирали или легкие позвоночных. Эту процедуру продемонстрирует доктор Джордж Литтлджон из моей лаборатории по изучению тканей листа. Подготовку образцов в PFD начинают с создания предметного стекла с газопроницаемой прокладкой из полидиметилсилоксана или PDMS; PDMS представляет собой вязкоупругий полимер, который можно формовать для создания камеры, соответствующей требованиям эксперимента.

Насытьте PFD воздухом, встряхнув небольшой объем PFD в наполненном воздухом флаконе. Это также можно сделать, пропуская струю воздуха через PFD; затем перелейте PFD в открытую чашку Петри и поместите на поверхность жидкости целый проросток или вырезанный фрагмент листа на пять минут. Ткань должна стать полупрозрачной, что напоминает витрифицированную ткань.

Листья могут выглядеть темнее или светлее, чем до воздействия PFD, в зависимости от условий освещения и возраста используемой ткани. Наконец, заполните камеру из PDMS аэрированным PFD и осторожно перенесите образцы ткани из инкубационной чашки Петри в камеру из PDMS. Закройте предметное стекло покровным стеклом и выполните визуализацию.

Согласно требованиям эксперимента, листья месячного возраста инкубировали в течение пяти минут в суспензии рекомбинантного зеленого флуоресцентного белка (GFP). Микроскопическое исследование образцов листьев, инкубированных в PFD, показывает, что большинство воздушных пространств заполнены рекомбинантным GFP, суспендированным в PFD. GFP окрашен в зеленый цвет, а красный цвет соответствует автофлуоресценции хлорофилла и клеткам мезофилла.

Очевидно, что при инкубации с PFD лист полностью заполняется жидкостью, хотя местами могут оставаться воздушные пузырьки. В данных условиях вода не заполняет лист полностью. Здесь листья opsys, экспрессирующие Venus (вариант YFP, локализующийся в цитозоле), инкубировали и монтировали в воздухе, воде или PFD для лазерного сканирования. Конфокальная микроскопия образцов демонстрирует преимущество PFD перед воздухом и водой, обеспечивая примерно двукратное увеличение глубины визуализации.

При сравнении PFD и воды, после освоения эта техника может занимать от пяти до 10 минут при правильном выполнении. Во время проведения данной процедуры важно помнить, что перфтордекалин растворяет лак для ногтей и тефлон, но совместим с силиконовой смазкой. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать перфтордекалин в качестве среды для монтажа для улучшения визуализации клеток листьев растений.

Не забывайте, что, хотя перфтордекалин нетоксичен, мы рекомендуем соблюдать стандартные правила техники безопасности при выполнении данной процедуры.