Формулировка диблок Полимерные наночастицы через Nanoprecipitation Техника

Общая цель данной процедуры — синтез полимерных наночастиц методом нанопреципитации. Это достигается путем первоначального проведения реакции с использованием E-D-C-N-H-S для получения сополимера A-P-L-G-A PEG. Затем сополимер PLGA PEG используется для создания наночастиц, инкапсулирующих интересующий препарат или груз посредством нанопреципитации.

На данном этапе можно провести базовую биофизическую характеристику, включая определение размера, поверхностного заряда и эффективности загрузки лекарственного средства, с помощью динамического рассеяния света, просвечивающей электронной микроскопии или ВЭЖХ. Значимость данного метода распространяется на терапию опухолей, поскольку наночастицы способны доставлять плохо растворимые противоопухолевые препараты, что может оказаться более эффективным, чем существующие методы лечения. Таким образом, данный метод позволяет расширить представления о лечении рака.

Этот метод также может быть использован для изучения других систем, таких как внутриклеточный транспорт. Наночастицы могут быть конъюгированы с таргетным лигандом и визуализированы in vivo или in vitro с помощью визуализирующего агента, демонстрирующего работу данной методики. Сегодня с нами будут два специалиста из нашей лаборатории, Rohit Sukumar и Natalie Cummings. Чтобы начать синтез сополимера PLGA-PEG, растворите карбоксилированный PLGA в ацетонитриле до концентрации 5 мМ при осторожном перемешивании.

Затем добавьте достаточное количество NHS и EDC для достижения концентрации 25 millimolar, что обеспечит пятикратный стехиометрический избыток по сравнению с PLGA. Осторожно перемешивайте раствор в течение примерно одного часа, чтобы карбоксилат PLGA преобразовался в PGA NHS. Через один час осадите продукт реакции PGA NHS, добавив промывочный раствор метанола в объеме примерно в 10 раз превышающем объем раствора. Центрифугируйте раствор при 2000 ×g для осаждения P-L-G-A-N-H-S. После центрифугирования слейте супернатант, чтобы удалить следы EDC и NHS. Эту процедуру промывки метанолом повторите не менее трех раз.

После завершения промывки высушите P-L-G-A-N-H-S в вакууме в течение 30 минут, чтобы удалить любые остатки промывочного раствора. Затем снова растворите осадок P-L-G-A-N-H-S в aceto NI trial в той же концентрации, которая изначально использовалась для растворения PLGA.

После растворения добавьте гетеробифункциональный PEG в раствор PLGA. Используйте концентрацию 5 мМ.

Инкубируйте смесь в течение 24 часов при постоянном перемешивании. Осадите продукт реакции блок-сополимера PLGA PEG, добавив избыток метанола. Повторите процесс промывки и центрифугирования еще три раза, чтобы удалить весь избыток не вступившего в реакцию peg.

В качестве заключительного этапа синтеза высушите блок-сополимер PLGA-PEG в вакууме. Осаждение наночастиц начинается с растворения блок-сополимера PLGA-PEG и инкапсулируемого препарата в растворителе A-P-L-G-A. Выбор растворителя имеет решающее значение, так как он влияет на свойства наночастиц. Затем по каплям добавьте смесь полимера и препарата в три-десять объемов перемешиваемой воды, чтобы получить конечную концентрацию полимера около 3 mg/mL. По каплям.

Добавление органического раствора в водную фазу имеет решающее значение для формирования наночастиц правильного размера. Продолжайте перемешивание в течение двух часов при пониженном давлении, чтобы наночастицы сформировались путем самосборки и удалились следы органического растворителя. После двух часов перемешивания.

Сконцентрируйте наночастицы путем центрифугирования при 2 700 ×g в течение 10 минут, используя фильтр Amon. Затем промойте наночастицы раствором PBS для удаления несвязанного препарата, после чего снова проведите центрифугирование. В завершение ресуспендируйте наночастицы в PBS.

Для лучшего понимания свойств наночастиц можно провести базовую биофизическую характеристику, включая определение размера, поверхностного заряда и эффективности загрузки лекарственного средства. Наночастицы можно хранить согласно описанию в письменном протоколе. Для характеристики наночастиц PLGA-PEG использовали просвечивающую электронную микроскопию, чтобы подтвердить размер, распределение и структуру наночастиц. Размер частиц обычно находится в нанометровом диапазоне.

Большие размеры частиц с неоднородным распределением по размеру могут указывать либо на ошибку в реакции конъюгации, либо на необходимость оптимизации метода наноосаждения. Здесь представлено исследование кинетики высвобождения лекарственного средства, в котором эффективность загрузки и высвобождение Paclitaxel количественно определяли с помощью стандартного ВЭЖХ. Известные фиксированные количества наночастиц подвергали диализу через фиксированные интервалы времени.

Содержимое диализного блока было собрано, и к нему добавили равный объем органического растворителя для растворения наночастиц. Затем эти образцы были проанализированы методом ВЭЖХ. Для количественного определения содержания паклитаксела, после освоения данного метода нанопреципитации, процедура может быть выполнена за три часа.

Помните, что при выполнении данной методики органическую фазу следует всегда добавлять к водной фазе медленно, чтобы предотвратить образование крупных частиц после ее введения. Этот метод открыл перед исследователями рака в области наномедицины возможность изучить применение плохо растворимых препаратов, которые ранее считались слишком токсичными для пациентов с онкологическими заболеваниями при использовании данной процедуры. Для ответа на такие вопросы, как эффективность плохо растворимых препаратов при отсутствии системной токсичности или точность доставки наночастиц в цель с помощью таргетных лигандов, могут быть проведены другие методы исследования, такие как изучение эффективности in vivo или методы визуализации.