Изоляция LacZ экспрессирующие клетки из тканей мышей Внутреннее ухо использованием проточной цитометрии

Общая цель следующего эксперимента заключается в выделении клеток, положительных по lax Z, из улитки новорожденной мыши с помощью проточной цитометрии. Это достигается путем первоначального выделения большого количества улиток мышей в относительно короткие сроки для сохранения жизнеспособности клеток и получения достаточного объема исходной ткани. На втором этапе клетки, положительные по LAX Z, диссоциируют и затем маркируют для подготовки ткани к сортингу.

Затем клетки сортируют методом проточной цитометрии. Полученные популяции LAX Z high и lax low можно использовать для дальнейших экспериментов. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области исследований слуха, например, каковы профили экспрессии генов или характеристики специфических популяций клеток внутреннего уха.

Процедуру продемонстрирует Таха Ген, студент медицинского факультета из нашей лаборатории. Сначала наполните чашки Петри диаметром 35 мм раствором HBSS и поместите их на ледяной блок. Затем с помощью ирисных ножниц проведите декапитацию 12–15 эвтаназированных постнатальных мышей линий axon, two laxy reporter и дикого типа в возрасте от 0 до 3 дней.

Поместите головы в чашку Петри диаметром 60 мм на лед. Затем с помощью пинцета Dumont №5 и ирисных ножниц удалите из голов нижнюю челюсть и язык, после чего сделайте разрез основания черепа на уровне неба. Теперь удалите кожу, покрывающую свод черепа, и рассеките основание черепа, введя ножницы от нижней части большого затылочного отверстия до середины неба.

Сделайте еще один разрез ножницами от срезанного края неба до верхней части калибра с обеих сторон, стараясь не повредить ототическую капсулу. Затем завершите изоляцию височной кости, сделав два разреза под углом 45 градусов, начиная от верхней части рамы и большого затылочного отверстия до коронального среза на твердом небе.

Затем поместите изолированные височные кости в чашки Петри диаметром 35 мм с HBSS на ледяной блок и перенесите ледяной блок в стерильный диссекционный бокс. Далее наполните еще одну чашку Петри диаметром 35 мм, на этот раз PBS, и поместите ее на ледяной блок. Используя два пинцета № 55.

Начните микродиссекцию с осторожного удаления коры, ствола мозга и мозжечка из височной кости, покрывающей оточную капсулу. Затем, не удаляя оточную капсулу, постепенно скалывайте части улиточной капсулы, начиная от входа вестибулокохлеарного нерва и продвигаясь вглубь оточной капсулы. После обнажения основания улитки осторожно извлеките кортиев орган и окружающие его ткани.

Затем, начиная с основания, удалите все остатки спирального ганглия и сосудистой полоски (stria vascularis) и перенесите улитку в чашку Петри с PBS. Сначала пипеткой внесите 50 µL стерильного PBS в центр одной или двух лунок ненанесенной шестилуночной культуральной пластины. Затем перенесите не более одной или двух улиток в каждую каплю PBS.

Затем предварительно прогрейте аликвоты 0,125% трипсина объемом 50 µL в течение примерно двух минут на водяной бане при 37 °C. После этого добавьте трипсин в улитку, стараясь не встряхивать чашку.

Инкубируйте улитку при 37 °C в течение восьми минут. Прекратите действие трипсина, добавив по 50 µL ингибитора трипсина из сои в каждую каплю, а затем добавьте еще 50 µL полной среды, установив дозатор P 200 на 125 µL. Используя наконечник для пипетки с тупым концом объемом 300 µL, осторожно тритурируйте клетки 80 раз, стараясь не создавать пузырьков.

После тритурации каждой капли добавьте в каждую из них еще по 200 µL полной среды. Затем пропустите клетки через клеточный фильтр с размером пор 40 микрон в новую лунку того же шестилуночного планшета, после чего перенесите клетки из каждой лунки в индивидуальные стандартные пробирки для проточной цитометрии.

Затем добавьте по 100 µL клеток дикого типа в каждую из трех пробирок, после чего разбавьте их 300 µL полной среды для группы CUG. Для контроля разбавьте 10 µL клеток axon two LAX Z в 390 µL полной среды. Перенесите оставшиеся клетки axon two lax Z в пробирки fax в 400 µL OTS.

Затем после инкубации пробирок в увлажненном инкубаторе при 37 °C в течение 10 минут добавьте по 200 µL разведенного CUG в каждую соответствующую пробирку fax. Далее, защищая все пробирки от света, инкубируйте клетки в увлажненном инкубаторе при 37 °C в течение 25 минут. Для окрашивания, пока клетки инкубируются, поместите 10 mL свежеприготовленного раствора heaps плюс FBS в пробирку объемом 15 mL и поставьте пробирку на лед.

Затем добавьте 1,8 milliliters ледяного раствора heap в каждую из пробирок fax под стерильным ламинарным шкафом при выключенном свете, чтобы минимизировать воздействие света. Далее центрифугируйте клетки при 1200 RPM в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 300 microliters полной среды.

Объедините все аликвоты для образца к сортировке, затем добавьте пропидий иодид в каждую соответствующую пробирку до конечной концентрации 1 µg/mL. Наконец, прикрыв клетки, снова поместите их на лед. Настройте гейты сортировки, предварительно собрав 1000 событий неокрашенных клеток дикого типа для определения распределения клеток на графике прямого светорассеяния по отношению к боковому светорассеянию.

Отрегулируйте параметры прямого и бокового светорассеяния по мере необходимости. Затем проведите компенсацию, используя неокрашенный дикий тип, дикий тип, окрашенный PI, и аксон, окрашенный CUG. Две клетки LAX Z.

Наполните две пробирки для FACS 500 µL полной среды. Затем начните анализ с клеток дикого типа, окрашенных PI и axon two Lae CUG, настроив гейт для исключения клеточного дебриса на основе графика прямого светорассеяния (FSC) по отношению к боковому светорассеянию (SSC). Исключите дуплеты и агрегаты, используя график высоты прямого светорассеяния (FSC-H) по отношению к площади прямого светорассеяния (FSC-A).

Затем исключите мертвые клетки, положительные по PI, на основе графика зависимости площади прямого светорассеяния (forward scatter area) от площади сигнала PE sci five. Для каждого установленного гейта постройте график зависимости площади прямого светорассеяния от площади сигнала cascade или Pacific blue. Проанализируйте 10 000 событий из пробирки с образцом для сортировки, содержащей клетки, окрашенные axon two laxy, PI и CUG, используя все гейты, установленные для клеток дикого типа, на основе графиков для клеток дикого типа.

Создайте гейты для клеток с высоким уровнем сигнала Cascade Blue, которые составляют менее 1% от общего количества событий. Гейты Cascade Blue High теперь должны содержать примерно 15–20% клеток в образце Axon two laxy. Используя график анализа клеток Axon two laxy для выделения этих высокоположительных клеток Axon two, создайте гейт для клеток с наименьшей флуоресценцией (15–20% клеток), используя вышеописанную стратегию гейтирования.

Отсортируйте клетки в пробирки FACS, содержащие полную среду, поддерживая пробирки для сбора в камере, охлажденной до 4 °C, во время сортировки. Запишите количество клеток, подсчитанных проточным цитометром для каждой популяции, на этих двух рисунках. Области бокового светорассеяния в зависимости от областей прямого светорассеяния для диссоциированных клеток дикого типа слева и axon two LA Z справа.

Представлены клетки улитки. Обратите внимание на выделение (гейтирование) отдельных групп событий значительно большего размера, чем события, расположенные ближе к оси Y и обозначенные как популяция без клеточного дебриса. Как правило, в обеих панелях из улиток дикого типа и axin two LAX Z восстанавливается от 40 до 45% клеток, очищенных от дебриса.

Зависимость высоты прямого светорассеяния от площади прямого светорассеяния используется для исключения дуплетов из предварительно отобранной фракции детрита. События с отрицательными значениями популяции, отклоняющиеся от ожидаемого линейного характера графика, исключаются. Такая подготовка обычно позволяет выделить 71.1% событий внутри назначенного гейта.

Пропидий иодид, детектируемый по пятому каналу PE SCI, используется для исключения мертвых клеток, что видно на данных диаграммах рассеяния. Около 95% отсортированных клеток были жизнеспособными и не поглощали PI на этих панелях. Канал Cascade blue использовался для детектирования флуоресцентного субстрата CUG, как показано на рисунке справа.

В среднем, верхние примерно 20% CUG-положительных клеток являются клетками с высоким уровнем экспрессии lae, что соответствует примерно 15 000 клеток с высоким уровнем экспрессии на 10–12 животных. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать и изолировать клетки с высоким уровнем экспрессии lae из тканей внутреннего уха с помощью проточной цитометрии как для экспериментов по клеточной сортировке, так и для таких исследований, как профилирование экспрессии генов.