Перенос генов в разработке мыши Внутреннее ухо по

Джейн перешла к теме «Развитие внутреннего уха мыши с помощью электропорации in vivo» Лин Ван, Хан Джан и Джон Бурганди, Центр исследований слуха Орегона, Университет здоровья и науки Орегона. Здравствуйте. Меня зовут Джон Бурганди. Моя лаборатория находится в Центре исследований слуха Орегона при Университете здоровья и науки Орегона.

Меня зовут Анг. Я работаю в лаборатории Джонса. Я также являюсь научным сотрудником в лаборатории Джонса.

Наша презентация разделена на четыре части. Первая часть посвящена вентральной лапаротомии. Мы демонстрируем проведение анестезии на основе пентобарбитала натрия, способы проверки адекватности анестезии, защиту роговицы, подготовку операционного поля, дезинфекцию, заполнение листа данных по выживаемости мышей при хирургическом вмешательстве, оснащение операционного блока, выполнение вентрального срединного разреза кожи и брюшной стенки, а также экстернализацию рогов матки.

Вторая часть посвящена транс-утерийной микроинъекции. Мы демонстрируем транс-иллюминацию эмбриона, переориентацию эмбриона, микроинъекцию, изготовление пипеток, а также микроинъекцию в отоцисту на 11,5-й и 12,5-й дни эмбрионального развития. Третья часть посвящена электропорации in vivo.

Мы демонстрируем установку электродов лопастного типа и электропорацию слухового аппарата эмбриона мыши на 11,5 день развития. Четвертая часть представляет собой описание типичных результатов. Мы показываем экспрессию GFP в улитках на поздних стадиях эмбрионального и ранних стадиях постнатального развития.

Это было получено в результате электропорации Otis с экспрессионной плазмидой in vivo на 11,5 эмбриональный день. Часть первая: вентральная лапаротомия. Самку фиксируют, плотно удерживая кожу за шеей, хвост и левую заднюю конечность. После протирания живота 70% ethanol вводят внутрибрюшинную инъекцию анестетика на основе пентобарбитала натрия.

Мышь помещают в домашнюю клетку на четыре-пять минут, чтобы дать анестетику подействовать. Для оценки адекватности анестезии используют щипковое воздействие на лапу и хвост. Данная самка реагирует на щипок за хвост вздрагиванием, поэтому ей требуется еще две минуты, прежде чем она перестанет реагировать на болевые стимулы.

В глаза вводят стерильную офтальмологическую мазь, чтобы защитить роговицу от пересыхания. Подготовку операционного поля проводят в вытяжном шкафу, чтобы минимизировать распространение шерсти и перхоти. Шерсть сбривают тонким лезвием, чтобы обнажить кожу, покрывающую брюшную стенку.

Полное удаление шерсти способствует заживлению разреза в послеоперационном периоде. Дезинфекция кожи брюшной полости проводится путем попеременного нанесения 70% ethanol, Betadine и 70% ethanol. Всегда протирайте от рострального к каудальному концу, используя новый стерильный ватный тампон или ватную палочку.

После каждого прохода мы оцениваем глубину и качество дыхания во время дезинфекции, чтобы убедиться, что животное не реагирует. После второго прохода 70% ethanol мы немедленно помещаем самку брюшной стороной вниз на стерильную салфетку и кладем её на грелку на две-три минуты для согревания. Это удобное время для записи предоперационных данных в журнал выживаемости мышей при хирургических операциях. Мы приложили наш лист данных по выживаемости мышей в хирургии в качестве дополнительной информации.

Рекомендуется приложить технический паспорт и протокол по уходу за животными, чтобы ваш институциональный комитет по уходу и использованию животных мог ознакомиться с тем, как вы будете отслеживать предоперационные, интраоперационные и послеоперационные данные. Мы заполняем один журнал регистрации для каждого подопытного животного, подвергаемого хирургическому вмешательству. Мы предпочитаем проводить операции в стерильной среде, хотя для грызунов это обычно не требуется.

Рабочая поверхность отделена от двигателя нагнетателя и корпуса пленума, поэтому вибрация не передается пользователю. В качестве дополнительной информации к процессу микроинъекций мы приложили схему модификаций, внесенных нами в ламинарный шкаф для облегчения переноса генов In utero; основные изменения включают вырезы для трековых светильников, скрытые розетки для шнуров питания приборов и маршруты прокладки вспомогательных электрических цепей. Хирургический набор состоит из пакета с раствором Рингера-лактата для внутривенного введения, водяной бани, XY Z-манипулятора, стереофлуоресцентного диссекционного микроскопа, волоконно-оптического источника света и хирургических инструментов.

Ножные педали используются для срабатывания микроинъектора, электропоратора и фокусировки. Хирургические инструменты для микроскопии стерилизуют в автоклаве. Инструменты должны быть повторно стерилизованы при переходе от одной мыши к другой с помощью стеклянного бисерного стерилизатора или путем повторного автоклавирования иглодержателя.

Необходимыми инструментами являются кольцевые зажимы Balli и сосудистые зажимы. Выполните разрез по вентральной срединной линии, захватите кожу сосудистым зажимом и иссеките кожный покров ножницами с тупыми концами, увеличив разрез до 10–14 Millimeters. Найдите белую аваскулярную полосу соединительной ткани, называемую linea alba, и вентральную срединную линию живота; рассеките linea alba ножницами с тупыми концами.

Будьте осторожны, чтобы не повредить кишечник или паховые жировые подушки. Немедленно промойте брюшную полость стерильным предварительно подогретым раствором Рингера-лактата. Осмотрите места разрезов кожи и брюшной стенки на наличие кровотечения.

Прямое давление тупыми пинцетами позволит остановить незначительное кровотечение, если оно возникло; извлеките правый и левый рога матки с помощью кольцевидных пинцетов. Осторожно захватите правый рог матки одним кольцевидным концом пинцета и выведите матку к срединному разрезу. Свободной рукой аккуратно манипулируйте боковой стороной тела самки, чтобы облегчить захват матки.

Пинцет никогда не используется для сжатия матки и ее вытягивания. Поскольку это может повредить сосуды матки или эмбрионы, повторите процедуру экстернализации для левого рога матки. Немедленно осторожно промойте недавно экстернализированные рога матки предварительно подогретым раствором Рингера-лактата, затем аккуратно верните на место внутренние жировые подушки или кишечник, если они вышли вместе с маткой.

Это встречается редко. Часть вторая: микроинъекция в матку. Самку размещают под объективом с большим рабочим расстоянием, а гибкий волоконно-оптический световод устанавливают вплотную к стенке матки.

Матку осторожно прижимают пальцем свободной руки, чтобы облегчить определение ориентации эмбриона. Интенсивность света от оптоволоконного кабеля должна быть минимальной, но достаточной для точной оценки ориентации эмбриона.

Интенсивный свет может передавать тепло матке, что может привести к осложнениям. Мы удерживаем волоконно-оптический световод и матку в одной руке, а пальцем свободной руки перемещаем эмбрион с помощью осторожной пальпации. В следующих трех видеоклипах с микроскопией EC мы демонстрируем типичные варианты расположения эмбрионов в матке.

Зритель увидит микроскопическое изображение, которое мы наблюдаем при проходящем освещении; хотя оно и черно-белое, проходящее освещение матки позволяет определить ориентацию эмбриона in vivo. В данном примере эмбрион находится в положении «вниз головой», при этом его вентральная поверхность обращена к зрителю. Перемещая матку вперед и назад, мы можем обнаружить правые и левые задние конечности, хвост и левый глаз цефалона.

В данном примере эмбрион снова находится в положении «головой вниз», но развернут примерно на 90 градусов относительно передне-задней оси. Осторожно покачивая матку вперед и назад, можно увидеть лопатообразные структуры, которые определяют левую заднюю и левую переднюю конечности. Также отчетливо виден ромбоцефалон.

Эмбрион расположен вертикально, его левая сторона обращена к наблюдателю. Зарождающийся четвертый желудочек виден в виде светлого участка в заднем мозге. Также отчетливо видны левый глаз, левая передняя и левая задняя конечности.

Легкое нажатие на матку немного переориентирует эмбрионы, что позволяет обнаружить основной ствол первичной головной вены, а также ее переднюю и заднюю ветви, отмеченные белой и черной звездочками соответственно. Как будет видно далее, орган Отис расположен посередине между передней и задней ветвями первичной головной вены. Сам орган Отис невозможно увидеть сквозь матку методом трансиллюминации.

В двух последовательных видеоклипах с использованием микроскопии мы демонстрируем, как переориентировать эмбрион для микроинъекции с помощью ассистента Otis. Цель состоит в том, чтобы определить эмбриональные ориентиры, позволяющие интерполировать местоположение otis в латеральной части головы. Таким образом, наша цель — перевести эмбрион из дорсального в латеральное положение, чтобы мы могли идентифицировать первичную вену головы.

В дорсальной позиции отчетливо видны средний мозг, четвертый желудочек и левая передняя конечность. При легком нажатии на матку ориентация эмбриона меняется с дорсальной на латеральную. Теперь легко различимы левый глаз, головной мозг, средний мозг и четвертый желудочек.

Также отчетливо видны основная вена головы и ее задняя ветвь, отмеченная звездочкой. Передняя ветвь основной вены головы не определяется четко. Наша цель снова состоит в том, чтобы ориентировать эмбрион таким образом, чтобы можно было идентифицировать основную вену головы, но при большем увеличении, подходящем для микроинъекции в матку.

На данном боковом ракурсе видны маточные сосуды, децидуальная полоса и левый глаз. Легкое нажатие на матку смещает положение эмбриона, что позволяет нам обнаружить четвертый желудочек и левый глаз. Основная головная вена и ее задняя ветвь, отмеченная звездочкой; основная головная вена и ее ветви по форме напоминают стойки для американского футбола.

Отическую везикулу не видно сквозь матку, но она расположена по центру между вертикальными стойками. Линн запустила последовательность инъекций для одного эмбриона. Она осуществляет трансиллюминацию матки, переориентирует эмбрион для микроинъекции и вводит в поле зрения микроинъекционную пипетку, заполненную красителем Fast Green.

Микроинъекционная пипетка закреплена в держателе, который зафиксирован в микromanипуляторе с осями X, Y, z. Магнитная подставка манипулятора прикреплена к стальной пластине с тефлоновым основанием, что позволяет легко осуществлять грубое позиционирование микроинъекционной пипетки. Игла продвигается соответствующим образом с помощью ручки управления микрометра перемещения вперед на манипуляторе.

Изготовленные пипетки необходимы для проведения травматической микроинъекции в эмбрион мыши на ранней стадии Отиса. Мы вытягиваем боросиликатные стеклянные капиллярные трубки с толстыми стенками с помощью горизонтального вытягивателя пипеток. Полученная пипетка, показанная на A, вручную разламывается пинцетом в месте внешнего диаметра примерно 14–16 микрон, указанном стрелкой на B. Грубый разлом пипетки, показанный на C, является зазубренным и хрупким.

Мы срезаем кончик пипетки под углом примерно 20 градусов, чтобы заострить его, как показано на панели D; параметры вытягивания и срезания микроинъекционных пипеток приведены в сопровождающем тексте. В следующих двух видеоклипах с использованием микроскопии мы демонстрируем микроинъекцию в отоцисту мыши на 11,5 и 12,5 эмбриональные дни. Наша цель — продемонстрировать микроинъекцию в отоцисту мыши на 11,5 эмбриональный день.

Сначала мы выполняем инъекцию в область ушных пузырей в отсутствие матки, чтобы однозначно продемонстрировать вид правильно направленной инъекции. Затем мы демонстрируем подлинную трансматочную микроинъекцию. Для первой инъекции матка была полностью рассечена, чтобы обеспечить выход висцерального мешка; при этом была удалена децидуальная полоса, покрывающая висцеральный желточный мешок.

Плацента остается прикрепленной к матке, эмбрион жив. При фокальном удалении матки видны четвертый желудочек, первичная головная вена и ее передняя и задняя ветви, пипетка и приблизительное расположение кисты, отмеченное белым цветом. В начале этой последовательности инъекций кровоток обнаруживается в сосудах висцерального желточного мешка.

Пипетку продвигают через висцеральный желточный мешок и вводят dai в область отоцисты, дорсально к эндолимфатическому протоку, располагая кончик пипетки в центре отоцисты. Отоциста находится посередине между передней и задней ветвями первичной головной вены; микроинъекция в отоцисту эмбриона мыши на 11,5 день развития требует обнаружения первичной головной вены и по крайней мере одной из ее ветвей для определения местоположения отоцисты.

На данном схематическом примере в качестве мишени выступают передняя и задняя ветви основной головной вены, при этом территория OUC отмечена белым цветом. Более реалистичным представлением эмбриона является случай, когда обнаруживается основной ствол основной головной вены только с одной из её ветвей; в представленном примере видна только задняя ветвь основной головной вены, но этого достаточно для интерпретации расположения отоцист. PT продвигают через матку и вводят краситель в отоцисты.

Мы выжидаем 30 секунд, чтобы краситель вымылся из амниотической полости, после чего становятся видны эндолимфатический проток с дорсальной стороны и вестибулярный аппарат. В завершение мы представляем обзор эмбриона при малом увеличении, в кисту которого только что была введена инъекция, чтобы обеспечить анатомическую перспективу: в этом ракурсе видны четвертый желудочек, левый глаз и сосуды матки. Мы демонстрируем транс- и микроинъекцию в отическую кисту эмбриона мыши на 12-й день развития и микроинъекцию в формирующийся четвертый желудочек заднего мозга.

Просвечивание позволяет обнаружить основную вену головы, а также глаз при данном левом латеральном ракурсе. Пипетку продвигают через матку в отоцистическую везикулу, после чего вводят краситель для заполнения ее просвета. Для инъекции в четвертый желудочек мы поворачиваем эмбрион на 90 градусов, чтобы получить дорсальный вид заднего мозга.

Введенная левая киста теперь находится с левой стороны. Пипетку продвигают через матку, и fast green смешивают с конъюгированным декстраном lor. Конъюгированный декстран вводят в четвертый желудочек.

Следует отметить, что объем введенного красителя не проникает в средний мозг in vivo. Флуоресценция оценивается после инъекции для подтверждения локализации декстрана в четвертом желудочке. Затем эмбрион переводят из дорсального в латеральное положение.

На данном латеральном срезе эндолимфатический проток расположен непосредственно вентральнее четвертого желудочка. Флуоресценция in vivo подтверждает локализацию декстрана в четвертом желудочке. При рождении мы проводим скрининг щенков на наличие зеленой флуоресценции в четвертом желудочке с помощью эпифлуоресцентной микроскопии.

При рассмотрении под диссекционным микроскопом щенков с зелельной флуоресценцией в области заднего мозга видно, что их внутреннее ухо подверглось манипуляциям во время эмбриогенеза, часть три: электропорация in vivo. После заполнения кисты экспрессионной плазмидой матку промывают свежим подогретым раствором Рингера-лактата. Трансиллюминация облегчает центрирование кисты ODU в поле электродов.

Металлическая головка оптоволоконного осветителя отводится от поверхности матки. Перед запуском серии прямоугольных импульсов в следующем видеоклипе с микроскопией мы демонстрируем полный цикл электропорации in vivo. Электропорация отического пузыря мыши на 11,5 эмбриональный день требует осторожного размещения электродов пластинчатого типа на матке.

В данном примере левая отоциста заполнена экспрессионной плазмидой, а матка была предварительно промыта раствором Рингера-лактата. Катод расположен латерально по отношению к заполненной отоцисте, а анод — медиально. В начале последовательности электропорации отоциста центрируется в поле электродов. Матку осторожно сжимают, после чего с помощью ножной педали запускают серию прямоугольных импульсов.

В идеале за один импульс подается ток силой от 60 до 100 мА. Затем матку отпускают и немедленно промывают. Промытую матку возвращают в брюшную полость, осторожно надавливая кольцевым зажимом.

После перемещения матки внутрь брюшную полость промывают примерно 4 мл раствора Рингера-лактата, оставляя около 1 мл раствора в брюшной полости для поддержания гидратации самки, которая сразу после операции на брюшной полости будет пить меньше воды, чем обычно. Брюшную стенку, а затем кожу зашивают рассасывающимся шовным материалом с помощью иглодержателя. В нашем иглодержателе есть встроенные ножницы, что упрощает зашивание.

Для ушивания брюшной стенки и кожи мы предпочитаем использовать непрерывный шов. Каждый второй стежок фиксируется для обеспечения дополнительной поддержки в области разреза. Перед помещением самки в клетку для восстановления мы подкожно вводим нестероидный противовоспалительный препарат.

Проконсультируйтесь с ветеринарным персоналом относительно того, какие профилактические анальгетики рекомендует ваш институциональный комитет по уходу и использованию животных. Самку помещают на дно обогреваемой клетки для восстановления, укрыв стерильной салфеткой. В клетке для восстановления должны находиться гнездовой материал, красная трубка для укрытия, лабораторный корм и бутылка с водой.

На следующее утро после операции клетка собирается заново с установкой фильтрующего колпачка сверху. Самка находится в ухоженном состоянии, передвигается самостоятельно и способна удерживать равновесие на задних конечностях, проявляя интерес к открытому верху клетки. Линия шва на брюшной стенке чистая, сухая; признаки расхождения, покраснения или отека отсутствуют.

Мы приложили документ, в котором обсуждается разработка протокола по уходу за животными при внутриутробном переносе генов. Этот документ содержит формулировки, которые могут быть полезны при разработке протокола для вашего конкретного учреждения в ходе консультаций с комитетом по уходу и использованию животных. Часть четыре, репрезентативные результаты.

На репрезентативных панелях результатов A и B показана типичная улитка детеныша шестого дня после рождения, которому на 11,5 эмбриональный день в отическую везикулу была введена плазмида для экспрессии усиленного зеленого флуоресцентного белка с последующей электропорацией. Латеральная стенка улитки была удалена в области среднего отдела и верхушки. Экспрессия GFP наблюдается только от основания до среднего отдела улитки и соответствует распределению маркера волосковых клеток myosin seven A, показанному на панели B. На панели C представлена конфокальная проекция при малом увеличении эмбрионального дня.

Орган Корте мыши на сроке 18,5 суток развития, иммуноокрашенный антителами к myosin seven A; трансфецированные клетки распределены по всему органу Корте. На панели D представлена конфокальная проекция с большим увеличением органа Корте эмбриона мыши на 18,5 сутки развития, окрашенного cin.Seven.

Экспрессия GFP обнаруживается во внутренних и наружных волосковых клетках, клетках Нерва (interphalangeal cells), столбообразных клетках и клетках TER. Перенос генов в отоцисту с помощью электропорации на 11,5 эмбриональный день позволяет трансфицировать клетки-предшественники, из которых развиваются все типы клеток, составляющие орган Корти.