Визуализация сосудистой Са ^{2 +} Сигнализация Срабатывание паракринной Производные ROS

Общая цель данной процедуры заключается в визуализации сосудистой кальциевой сигнализации, запускаемой активными формами кислорода (АФК), вырабатываемыми при перикриновой передаче. Это достигается путем первоначальной визуализации АФК в активных макрофагах с помощью окислительно-чувствительных красителей. АФК также могут быть визуализированы в эндотелиальных клетках с использованием флуоресцентных сенсоров на основе плазмид.

Затем приступайте к одновременной визуализации активированных макрофагов, меченных Cell Tracker Red, и эндотелиальных клеток, меченных Fluo-4, в модели сокультивирования. Наконец, измерьте кальциевый сигнал в эндотелиальных клетках, вызванный активными формами кислорода (ROS), вырабатываемыми макрофагами, с помощью системы конфокальной микроскопии.

Эти результаты позволяют независимо демонстрировать уровни ROS, а также одновременно оценивать мобилизацию внутриклеточного кальция, вызванную ROS, производными Peregrine. Данный метод обеспечивает одновременную оценку двух различных сигнальных молекул, которые тесно взаимодействуют, вызывая сосудистую сигнализацию и имитируя патофизиологические условия. Два постдока из моей лаборатории, Картик и Радж, продемонстрируют процедуру измерения ROS и кальция, а также взаимодействие макрофагов и эндотелиальных клеток.

Культивируйте макрофаги мыши, полученные из моноцитов, в 35-миллиметровых чашках с стеклянным дном. Затем подвергните клетки воздействию агонистов Toll-подобных рецепторов и инкубируйте в течение шести часов при 37 °C. Для визуализации цитозоля.

Для определения АФК добавьте окислительно-чувствительный краситель и инкубируйте клетки в течение 20 минут. Затем визуализируйте клетки на предметном столике с контролем температуры конфокальной imaging-системы. В качестве альтернативы, для визуализации митохондриальных АФК в TLR-активированных клетках, добавьте индикатор митохондриального супероксида и инкубируйте клетки в течение 30 минут при 37 °C.

В качестве отрицательного контроля обработайте клетки либо PBS, либо DMSO. Для положительного контроля обработайте клетки 2 мМ антимицина. Затем приступайте к визуализации всех клеток на предметном столике с контролируемой температурой системы конфокальной микроскопии.

С помощью программного обеспечения Image J проанализируйте все полученные изображения. Флуоресцентный сенсор hyper специфически определяет субмикромолярные концентрации пероксида; исходя из особенностей экспрессии в клетках млекопитающих, конструкция вектора может быть направлена либо в цитоплазму, либо в митохондрии. Методом электропорации создайте стабильные линии микрососудистых эндотелиальных клеток легких мыши с соответствующей плазмидой для гиперэкспрессии.

Для стимуляции роста колоний посейте клетки с низкой плотностью в полную среду TMEM и инкубируйте в течение 48 часов, затем замените среду на полную культуральную среду с добавлением селективного антибиотика. Проведите скрининг клонов для выявления тех, что имеют наибольший процент гиперположительных клеток, и амплифицируйте культуру для создания стабильных гиперположительных линий для индивидуальных экспериментов. Посейте клетки на покровные стекла, покрытые 0,2% желатином, и культивируйте в течение ночи до достижения 80% конфлюэнтности.

Теперь активируйте клетки с помощью лигандов TLR и инкубируйте в течение шести часов при 37 °C. Для детекции цитоплазматических АФК закрепите покровные стекла с клетками в камере для клеток Adelo. Добавьте 1 мл предварительно подогретого сбалансированного солевого раствора Хенкса и поместите камеру на платформу с контролируемой температурой конфокальной системы визуализации.

Зарегистрируйте изменения флуоресценции в клетках для детектирования митохондриальных ROS. В качестве положительного контроля используйте 2 µM антимицина А. Затем подготовьте покровные стекла с обработанными клетками для конфокальной микроскопии. Выполните анализ изображений с помощью программного обеспечения ImageJ.

Для визуализации и измерения внутриклеточных изменений уровня кальция используйте эндотелиальные клетки, выращенные до 80% конфлюэнтности на стеклянных покровных стеклах, покрытых желатином. Инкубируйте клетки с флуоресцентным красителем fluo-4 AM при комнатной температуре в течение 30 минут; для минимизации потери красителя промойте клетки экспериментальным имиджинговым раствором, содержащим sulpyrozone. Затем закрепите покровные стекла в камере для клеток Adelo с добавлением 800 µL предварительно нагретого экспериментального имиджингового раствора и поместите клетки на столик с контролем температуры системы конфокальной микроскопии в отдельной пробирке.

Используйте CellTracker Red CMTPX в концентрации 500 нг/мл в течение 15 минут для маркировки исследуемой популяции макрофагов, затем промойте клетки и ресуспендируйте осадок в 200 мкл экспериментального раствора для визуализации. Добавьте маркированные макрофаги к эндотелиальным клеткам, нагруженным Fluo-4 AM, в конфокальной камере. Регистрируйте зеленую и красную флуоресценцию каждые 3 секунды в течение 10 минут.

В данном эксперименте клетки J 7 74 0.1 подвергали воздействию лигандов TLR 2, 3 и 4 в течение шести часов. Репрезентативные изображения, полученные с помощью конфокальной микроскопии, демонстрируют повышение уровня цитозольных R os, измеренного с помощью DCF. Примечательно, что красная флуоресценция mitoses socks указывает на аналогичное увеличение содержания митохондриальных ROS.

Эти изменения флуоресценции носят количественный характер. Таким образом, результаты должны быть нормализованы и выражены как относительное кратное изменение для каждого варианта обработки; сигнал антимицина А служит положительным контролем продукции митохондриальных АФК. На этом рисунке представлены изображения уровней перекиси в эндотелии, цитозоле и митохондриях при стабильной экспрессии hyper cyto или hyper D mito.

MP ECS, стимулированные агонистами TLR. Количественное определение среднего изменения флуоресценции демонстрирует увеличение флуоресценции hyper cyto и hyper D mito после шести часов стимуляции в системе кокультивирования. Для оценки передачи сигналов Peregrine ROS свежевыделенные макрофаги из мирин мышей как дикого типа, так и с делецией GP 91 Fox, активировали с помощью 1 µg/mL LPS в течение шести часов.

Макрофаги были помечены красным красителем C-M-T-P-X и добавлены к MPM ECS, предварительно нагруженным зеленым флуоресцентным красителем. Примечательно, что LPS-активированные макрофаги, выделенные из мышей дикого типа, вызывали мощную и быструю мобилизацию кальция в MPM ECS по сравнению с макрофагами мышей с нокаутом по гену GP 91 Fox.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что как длительное время выдержки, так и воздействие лазера приводят к автоокислению DCF. Крайне важно избегать фотообесцвечивания hyper cyto и hyper D mitral. После освоения методики измерение RA в макрофагах, а также в эндотелиальных клетках, может быть выполнено за семь часов при условии правильного проведения протокола.