Мониторинг актина Разборка с покадровой микроскопии
8 ноября 2006 г.
Итак, сегодня я хочу показать вам, как сконструировать проточную камеру, камеру для слияния, предназначенную для визуализации на микроскопе с вертикальным освещением. Для этого я создаю два пространства с помощью пленки. Я беру парафильм и нарезаю его на узкие полоски.
Далее я сформирую каналы для стенок и просушу их струей воздуха под наклоном. Я помещу покровное стекло поверх парафина, и вот результат. Затем я нагрею образец на термоблоке, чтобы расплавить парафин и обеспечить герметизацию.
Перед нами покровное стекло, на котором, как видно здесь, расположены два слоя пленки. Сверху на них снова находится покровное стекло размером 22 на 22 мм. Вот оно, я прижал его к пленке, чтобы создать герметичную печать.
Итак, жидкость поступает здесь в одном направлении, и я могу вытянуть ее с помощью фильтровальной бумаги в этом направлении. Я покажу вам, как это сделать, чуть позже. Обычно я помещаю образец в увлажненную камеру, устройство которой очень простое.
Возьмите две приподнятые полоски и поместите под них фильтровальную бумагу. Чтобы избежать попадания пузырьков воздуха, накройте проточную камеру покровным стеклом. Для введения раствора в камеру просто приставьте наконечник пипетки к входу в камеру и медленно введите жидкость.
Теперь я инкубирую камеру с закрытой крышкой в течение 10 минут. Чтобы удалить жидкость с другой стороны, я обычно использую фильтровальную бумагу, разрезанную на такие тонкие полоски. Я беру одну из этих полосок и одновременно ввожу раствор через вход, прикладывая фильтровальную бумагу к выходу, чтобы удалить заменяемый раствор.
Таким образом, вы увидите, как жидкость проходит через раствор. Затем я жду пять минут до полного закрытия. Теперь я готов добавить актин; фактически мне необходимо полимеризовать актин, и я провожу полимеризацию непосредственно в проточной камере, используя те же процедуры, что и ранее.
Таким образом, после того как актин полимеризовался, я вымываю весь избыток неполимеризованного актина, используя большой объем одного лишь буфера. Здесь у меня около 100 µL, что соответствует нескольким объемам реакционной камеры. Когда фильтровальная бумага насыщается, мне приходится менять направление. Хорошо?
Теперь я готов приступить к визуализации. Перфузионная камера с прикрепленным к ней актином готова. Теперь я беру предметное стекло, помещаю его под микроскоп и, поскольку я провожу визуализацию с использованием масляного объектива, нанесу иммерсионное масло на верхнюю поверхность покровного стекла, чтобы оценить раствор, белок или любые другие вещества, взаимодействующие с актином внутри.
Таким образом, я могу заменять раствор в рабочем канале непосредственно в процессе проведения таймлапс-визуализации.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье демонстрируется изготовление проточной камеры и камеры для слияния для получения изображений на вертикальном микроскопе. Процесс включает создание каналов с помощью парафильма и их герметизацию с помощью нагрева.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология
Теоретические сведения
- Проточные камеры необходимы для различных методов визуализации.
- Создание комбинированной камеры позволяет расширить возможности визуализации.
- Парафильм обычно используется в лабораторных условиях для обеспечения герметичности.
- Понимание процесса конструирования имеет решающее значение для исследователей в данной области.
Цель исследования
- Предоставить пошаговое руководство по конструированию проточной камеры.
- Продемонстрировать использование парафильма при создании камер для визуализации.
- Повысить доступность методов визуализации для исследователей.
Используемые методы
- Разрезание парафильма на полоски для формирования каналов.
- Просушивание полосок потоком воздуха под наклоном.
- Размещение покровного стекла поверх парафильма.
- Нагревание сборки на термоблоке для создания герметичного соединения.
Основные результаты
- Была успешно сконструирована функциональная проточная камера.
- Процесс герметизации оказался эффективным для создания стабильной среды для получения изображений.
- Продемонстрированный метод воспроизводим для лабораторного использования.
- Исследователи могут использовать данную методику для различных задач визуализации.
Выводы
- Конструкция проточных камер и камер для слияния проста в исполнении.
- Данный метод может способствовать проведению расширенных исследований с применением методов визуализации.
- Доступность таких методов может улучшить результаты исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол позволяет воспроизводимо подготавливать контролируемые микроокружения для визуализации живых клеток, что способствует механистическим исследованиям динамики цитоскелета. За счет стандартизации сборки проточной камеры снижается вариабельность в анализах на основе перфузии, что повышает согласованность данных между исследовательскими группами. Метод облегчает количественный анализ кинетики разборки актина — ключевого процесса в подвижности клеток и передаче сигналов, имеющего важное значение для валидации мишеней в онкологии и иммунологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает возможность прямого наблюдения за динамикой деполимеризации актина для изучения регуляторов перестройки цитоскелета.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированную платформу для тестирования влияния соединений на оборот актина в живых клетках.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: способствует разработке флуоресцентных методов регистрации скорости деполимеризации актина в качестве функциональной конечной точки анализа.
- Практическая ценность: позволяет осуществлять замену раствора во время таймлапс-визуализации для оценки зависимости «доза — ответ» в условиях перфузии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: связывает динамику актина с клеточными фенотипами, имеющими значение для метастазирования, инвазии и формирования иммунного синапса.
- Практическая ценность: позволяет проводить доклиническую оценку ингибиторов соответствующих путей с использованием количественных визуализационных биомаркеров.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от скрининга взаимодействия с мишенью до функциональной валидации в клеточных системах, релевантных конкретному заболеванию.
- Основополагающая биология: обеспечивает проверку гипотез о регуляторах цитоскелета посредством визуализации потока актина в режиме реального времени.
- Скрининг: обеспечивает количественные, воспроизводимые измерения разборки актина в контролируемых условиях перфузии.
- Аналитика: генерирует данные об интенсивности флуоресценции с временным разрешением, позволяющие осуществлять кинетическое моделирование обновления актина.
- Трансляционные исследования: связывают молекулярные механизмы с клеточными фенотипами в доклинических моделях миграции клеток.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую перфузионную платформу, адаптируемую к различным мишеням цитоскелета и типам клеток.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Механистическое снижение рисков при работе с мишенями, участвующими в регуляции актина, посредством прямого считывания функциональных показателей.
- Операционная ценность: Стандартизированная подготовка камеры повышает воспроизводимость анализа в различных центрах и при работе разных операторов.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на более ранних этапах путем установления связи между модуляцией мишени и функциональными изменениями цитоскелета.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию соединений с учетом рисков на основе их воздействия на фенотипы подвижности и инвазии клеток.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области визуализации живых клеток и микрофлюидного управления потоком.
- Метод зависит от наличия вертикальных микроскопов с системой контроля параметров окружающей среды и возможностью перфузии.
- Для обеспечения однообразия между камерами необходима стандартизация толщины парафильма и параметров герметизации.
- Адаптация метода для различных типов клеток может потребовать оптимизации покрытия поверхности и условий полимеризации актина.
- Практические ограничения включают возможные эффекты напряжения сдвига, воздействующего на клетки при длительной перфузии, как отмечено в протоколе.
