Применение MassSQUIRM для количественного измерения Лизин активность деметилазы
11 марта 2012 г.
Мы представляем способ использования MALDI масс-спектрометрии и восстановительной химии метилирования количественного изменения в лизин метилирования.
Протокол mass squirm предназначен для количественного определения активности лизин-деметилазы с использованием изотопного метилирования и масс-спектрометрии MALDI. Сначала проводят ферментативные реакции деметилирования пептидов, содержащих метилированный лизин. Затем продукты реакции деметилазы химически метилируют дейтерированным формальдегидом для получения равномерно метилированных пептидов, которые ионизируются при MALDI одинаковым образом. После этого с помощью масс-спектрометрии MALDI количественно определяют каждый вид пептидов с учетом изотопного перекрытия. Для идентификации относительного количества неметилированных, моно-, ди- и триметилированных пептидов результаты mass squirm позволяют определить относительное содержание каждого продукта реакции деметилазы на основании изменения массы.
Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как рутинная масс-спектрометрия, является то, что оценка массы учитывает различия в ионизации между пептидами с разной степенью метилирования. Впервые идея этого подхода возникла у нас при разработке метода измерения уровней ацетилирования гистонов с использованием изотопно-меченого уксусного ангидрида. Сложность данной методики заключается в извлечении данных о площади пиков, что может быть затруднено из-за перекрытия изотопных конвертов пептидов.
Для проведения реакции деметилирования смешайте 125 nanograms рекомбинантного фермента лизин-специфической деметилазы 1 с 0.25 micrograms биотинилированного диметилгистона H3 пептида в конечном объеме 20 microliters буфера для деметилазы. Также подготовьте контрольный образец, содержащий 0.25 micrograms пептида без фермента LSD1. Инкубируйте пробирки с реакцией и контролем в течение двух часов при 37 °C. Затем для подготовки бусин с порами 20 micron смешайте равные объемы бусин и метанола.
Затем добавьте 10 объемов ТФА-муравьиной кислоты, добавьте восемь микролитров пористых бусин в каждый образец и перемешивайте в течение 15 минут при комнатной температуре. Тем временем подготовьте два C 18 zip tip. Проведите двукратное пипетирование 20 микролитрами 0,1% TFA, затем четыре раза — 70% ацетонитрилом с 0,1% TFA и еще четыре раза — 0,1% TFA.
Затем нанесите два образца на кондиционированные zip-типы. С помощью дозатора пропустите весь объем через смолу C 18. Повторяйте процедуру до тех пор, пока весь объем обоих образцов не будет пропущен через zip-типы.
Затем дважды промойте zip-наконечники 20 µL 0,1% TFA, элюируйте образцы в 40 µL элюирующего буфера и полностью высушите их с помощью вакуум-концентратора SpeedVac. Сначала ресуспендируйте образец в 100 µL 50 мМ фосфатного буфера (pH 7.4). Затем добавьте 8 µL бор-диметиламина и 16 µL дериватизирующего формальдегида.
Инкубируйте при температуре 4 °C в течение двух часов. Повторите восстановительное метилирование, добавив боргированный диметиламин и дейтерированный формальдегид, и инкубируйте в течение двух часов. В третий раз добавьте боргированный диметиламин и инкубируйте при температуре 4 °C в течение 15 часов.
Остановите реакцию, добавив 12.5 µL 1 M Трис-буфера (pH 7.4), затем полностью высушите осадок с помощью вакуум-концентратора SpeedVac. После этого ресуспендируйте контрольный образец и образцы с деметилазой в 100 µL 50 mM фосфатного буфера (pH 7.4).
Теперь добавьте 8 µL пористых микросфер в контрольный образец и образец с деметилазой, затем соберите их с помощью zip-типов, как было показано ранее. Элюируйте порциями по 2 µL на планшет для MALDI и дайте образцам высохнуть при комнатной температуре до кристаллизации. Перейдите к анализу образцов методом масс-спектрометрии.
Откройте спектрограммы в рабочем программном обеспечении и экспортируйте их в ПО M over Z. Далее подтвердите состав продуктов реакции с помощью тандемной масс-спектрометрии. Сначала определите отношение площадей пиков изотопов углерода 13 C two и углерода 13 C four относительно моноизотопного пика для контрольного образца.
Используйте эти рассчитанные соотношения для количественного определения относительного содержания пептида в каждой модификации. Состояние образца реакции деметилирования. Фермент LSD может быть эффективно использован для количественного анализа деметилирования лизина методом масс-спектрометрии.
Поскольку в контрольной реакции не происходит восстановительного метилирования, она демонстрирует типичный изотопный профиль для данного пептида. Площади полученных пиков определяют фоновое соотношение пептидов, содержащих 13C2 и 13C4. Изотопные состояния и площади пиков масс-спектра контрольной реакции позволяют количественно оценить относительное содержание пептида в каждом состоянии модификации. В реакции с деметилазой площади пиков в контрольной и экспериментальной реакциях определяют 33,7% диметиллизина 4, 42,3% монометиллизина 4 и 24% неметилированного лизина 4.
Данный метод масс-спектрометрии позволяет получить важные сведения в области эпигенетики гистонов, например, о том, как деметилирование остатков лизина гистонов способствует развитию различных заболеваний. Хотя этот анализ метилирования применялся для изучения деметилаз, он также может быть использован для изучения метилтрансфераз.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод количественного определения активности лизин-деметилаз с использованием масс-спектрометрии MALDI и химии восстановительного метилирования. Этот подход позволяет измерять изменения уровней метилирования лизина с помощью изотопного мечения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Масс-спектрометрия
Теоретические основы
- Метилирование лизина является критически важной посттрансляционной модификацией.
- Понимание активности деметилаз имеет важное значение для эпигенетических исследований.
- Существующие методы могут не учитывать различия в ионизации метилированных пептидов.
- Данное исследование основывается на предыдущих работах по измерению ацетилирования гистонов.
Цель исследования
- Разработать надежный метод количественного определения активности лизин-деметилазы.
- Повысить точность масс-спектрометрии при обнаружении изменений метилирования.
- Изучить динамику метилирования лизина в биологических системах.
Используемые методы
- Реакции деметилирования метилированных лизиновых пептидов, катализируемые ферментами.
- Химическое метилирование продуктов реакции деметилазы дейтерированным формальдегидом.
- Использование MALDI-масс-спектрометрии для количественного анализа.
- Анализ изотопного перекрытия для определения относительного количества пептидов.
Основные результаты
- Успешное количественное определение немодифицированных и метилированных форм пептидов.
- Демонстрация преимуществ данного метода по сравнению с традиционной масс-спектрометрией.
- Выявление проблем, связанных с извлечением данных о площади пиков.
- Валидация подхода с помощью сравнительного анализа.
Выводы
- Данный метод предлагает новый подход к изучению динамики метилирования лизина.
- Он углубляет понимание активности деметилаз в биологическом контексте.
- В дальнейшем этот метод может быть применен в различных областях эпигенетики и протеомики.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Количественное измерение активности лизин-деметилаз имеет решающее значение для валидации эпигенетических мишеней и идентификации ведущих соединений при разработке лекарственных препаратов. Метод MassSQUIRM устраняет основной недостаток существующих анализов, обеспечивая возможность прямого сравнения состояний метилирования с помощью изотопной стандартизации, что повышает прогностическую достоверность при снижении рисков, связанных с механизмами действия эпигенетических мишеней. Это способствует принятию решений на ранних этапах разработки, предоставляя воспроизводимые количественные данные о взаимодействии с мишенью и модуляции сигнальных путей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения активности деметилазы на определенных пептидных субстратах.
- Практическая ценность: Предоставляет стандартизированный метод сравнения неметилированных, моно-, ди- и триметилированных состояний лизина, что снижает механистическую неопределенность при валидации мишени.
- Прогностическая ценность: Способствует приоритизации портфеля препаратов за счет получения количественных данных об активности, которые коррелируют с взаимодействием с мишенью и модуляцией сигнального пути.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение равномерно ионизируемых пептидов путем восстановительного метилирования, что позволяет проводить надежное количественное определение методом MALDI-MS независимо от степени метилирования.
- Масштабируемость: совместимость с адаптацией под планшетный формат для проведения скрининга библиотек соединений против мишеней-деметилаз со средней пропускной способностью.
- Воспроизводимость: корректирует различия в ионизации метилированных пептидов, обеспечивая согласованность количественных результатов в разных экспериментах и лабораториях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает согласованность с системами, релевантными для заболевания, путем количественной оценки активности деметилаз в контексте гистоновых и негистоновых белков.
- Механистическое снижение рисков: позволяет осуществлять лонгитюдный мониторинг модуляции мишени в доклинических моделях за счет количественного определения состояния метилирования.
- Согласованность биомаркеров: облегчает оценку изменений метилирования в качестве потенциальных фармакодинамических биомаркеров в исследованиях по взаимодействию с мишенью.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Метод MassSQUIRM вписывается в континуум ранних этапов поиска лекарственных средств, связывая валидацию мишени с помощью количественного биохимического анализа с идентификацией соединений-лидеров и доклинической оценкой за счет обеспечения масштабируемых и воспроизводимых измерений активности.
- Биологические исследования: Оказывает поддержку при проверке гипотез и уточнении сигнальных путей путем количественного определения фермент-специфической деметилирующей активности на синтетических пептидных субстратах.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизацию анализа и получение количественных данных для кампаний по скринингу соединений, нацеленных на лизин-деметилазы.
- Аналитика: Предоставляет соотношения площадей изотопных пиков, которые позволяют напрямую сравнивать состояния модификации, что способствует принятию решений на основе данных при переходе от хитов к лидам.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты с доклинической работой, позволяя измерять активность деметилаз в пептидных и белковых субстратах, имеющих значение для конкретных заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для характеристики эпигенетических мишеней в рамках нескольких проектов и терапевтических областей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Количественная оценка активности деметилазы, снижение систематической ошибки ионизации при сравнении состояний метилирования и повышение достоверности определения мишени.
- Операционная ценность: Стандартизация ионизации пептидов, воспроизводимость на различных платформах MALDI-MS и возможность масштабирования для высокопроизводительных форматов.
- Стратегическая ценность: Принятие обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») на основе количественных данных о модуляции мишени, что снижает биологические риски в эпигенетических программах.
- Влияние на портфель: Приоритизация эпигенетических мишеней с учетом рисков за счет надежного профилирования активности и понимания механизмов действия.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области энзимологии, пептидной химии и интерпретации данных масс-спектрометрии MALDI.
- Зависимость от наличия оборудования для MALDI-MS и реагентов для изотопного восстановительного метилирования (дейтерированный формальдегид, боран-диметиламин).
- Необходимость использования стандартизированных протоколов синтеза пептидов, подготовки ферментативных реакций и обеспечения согласованности изотопного мечения между исследовательскими группами.
- При адаптации метода следует учитывать субстратную специфичность и совместимость с различными пептидными последовательностями, помимо гистона H3.
- Практические ограничения включают сложности при деконволюции площади пиков из-за перекрывания изотопных профилей, что требует тщательного спектрального анализа и использования специализированного программного обеспечения.
![Разработка и определение характеристик In Vitro Микрососудов Сеть и количественные измерения эндотелиальной [Са 2+] я И оксид азота Производство](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
