Количественные, в режиме реального времени анализ базы активность репарации в клеточных лизатов Использование Поражение конкретные молекулярные маяки

Общая цель следующего эксперимента заключается в измерении скорости репарации ДНК в ядерных экстрактах клеток в режиме реального времени с использованием молекулярных маяков, которые начинают флуоресцировать после восстановления. Молекулярные маяки для базовой эксцизионной репарации состоят из дезоксиолигонуклеотидов в структуре «шпилька», содержащей единичное повреждение основания, с флуоресцеиновыми фрагментами 6-FAM, конъюгированными с 5'-концами, и фрагментами Dabcyl, конъюгированными с 3'-концами в сложенном состоянии. Флуоресценция 6-FAM гасится Dabcyl посредством нерадиационного переноса энергии по принципу Фёрстера.

Для оценки активности репарации ДНК маяки инкубируют с ядерными экстрактами клеток, содержащими ферменты репарации. ДНК-гликозилаза распознает и удаляет повреждение ДНК в маяке. Образующиеся ABA-сайты служат субстратами для АП-эндонуклеазы 1 (APE1). После распознавания APE1 расщепляет остов ДНК в области ABA-сайта, что позволяет фрагменту ДНК, содержащему 6-FAM, свободно диссоциировать от шпильки.

Отсоединение от гасителя приводит к увеличению флуоресценции, которая пропорциональна уровню репарации ДНК и может быть оценена в режиме реального времени с помощью прибора для количественной ПЦР в реальном времени. Способность восстанавливать повреждения ДНК имеет решающее значение для каждой клетки и каждого организма. Среди множества клеточных путей репарации ДНК эксцизионная репарация оснований направлена на поврежденные основания, которые могут возникнуть в результате окислительного или химического воздействия; выяснение роли отдельных клеточных элементов, которые могут влиять на эксцизионную репарацию оснований, является одной из главных целей исследований в нашей лаборатории.

В связи с этим в нашей лаборатории возник интерес к точному и чувствительному измерению активности репарации ДНК. Данный анализ позволяет получить такие данные. Основным преимуществом этого метода перед существующими, такими как мечение 32P и анализ с помощью гель-электрофореза, является то, что наш метод не использует радиоактивно меченные субстраты, позволяет измерять скорость репарации ДНК в режиме реального времени и обладает очень широким динамическим диапазоном.

Кроме того, данный подход позволяет использовать несколько различных флуорофоров и/или повреждений оснований для определения субстратной специфичности. Мы показали, что этот анализ является высококоличественным и очень чувствительным в различных условиях. Данный анализ с использованием молекулярных маяков для эксцизионной репарации оснований подходит для кинетического анализа.

Высокая чувствительность и специфичность данного анализа позволяют точно количественно определять эксцизионную репарацию оснований, что делает его полезным для скрининга или валидации ингибиторов репарации. Кроме того, метод может быть адаптирован для измерения активности репарации в тканях и лизатах опухолевых клеток с целью функционального измерения биомаркеров. При разработке молекулярных маяков для этого анализа следует использовать следующие ДНК-олигонуклеотиды длиной 43 основания, как показано здесь.

Работайте аккуратно. Последовательность ДНК не является уникальной, но должна обеспечивать возможность формирования шпилечной структуры. В таком согнутом состоянии, как показано здесь, специфичность достигается путем введения специфических повреждений оснований, таких как урацил или тетрагидрофуран.

В позиции X, в шести основаниях от 5'-конца, содержание ГЦ должно составлять не менее 32%, при этом основание Г в позиции 5'-конца недопустимо. К 5'-концу должен быть конъюгирован 6-карбоксифлуоресцеин или 6-FAM, а 3'-конец должен быть модифицирован dab sil. Это будет служить субстратом для белков репарации ДНК, чтобы обеспечить связывание и активность гликозилаз.

Положение повреждения было выбрано таким образом, чтобы обеспечить достаточное расстояние от структуры «шпильки» и конца ДНК. Длина стебля или дуплекса «шпильки» должна составлять не менее 15 пар оснований. Рекомендуемая длина петли — 13 оснований.

Контрольный молекулярный маяк должен быть идентичен экспериментальному молекулярному маяку, за исключением того, что он не содержит повреждения ДНК. Следовательно, он не должен распознаваться ферментами репарации ДНК. После получения молекулярных маяков необходимо провести оценку качества, чтобы убедиться, что маяки не флуоресцируют до нагревания.

Для определения оптимальной температуры плавления все этапы процедуры экстракции следует проводить на льду или при температуре 4 °C. Чтобы обеспечить стабильность белка, подготовьтесь к эксперименту, предварительно охладив оборудование. Для каждого образца потребуются два стакана объемом 1 л, диализный буфер, диализные камеры, микроцентрифужные пробирки, шприцы и иглы.

Маркируйте конические пробирки объемом 15 мл и поместите их на лед. Аспирируйте ростовую среду из чашек с клетками, затем дважды промойте клетки 7,5 мл холодного PBS. После второго промывания добавьте в каждую чашку пять мл холодного PBS и с помощью скребка для клеток (cell lifter) снимите клетки с поверхности пластины.

Перенесите клетки в охлажденную коническую пробирку объемом 15 мл, затем центрифугируйте при 500 ×g при температуре 4 °C в течение пяти минут. После центрифугирования удалите супернатант и оцените объем осадка клеток, сравнив его с известными объемами жидкости в аналогичных пробирках. Центрифугируйте пробирки еще одну минуту, а затем удалите остатки PBS с помощью пипетки.

Ресуспендируйте осадок клеток в 150 мкл экстракционного реагента Nuke Buster 1 на каждые 50 мкл объема упакованных клеток. Затем перенесите ресуспендированные клетки в предварительно охлажденную пробирку объемом 1,5 мл и перемешайте на вортексе в течение 15 секунд на высокой скорости. После вортексирования выдержите пробирку на льду в течение пяти минут, затем снова перемешайте на вортексе в течение 15 секунд и центрифугируйте при 13 000 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C.

После центрифугирования удалите и утилизируйте супернатант, содержащий цитоплазматическую фракцию. Ресуспендируйте осадок в смеси 1 µL 100-кратного коктейля ингибиторов протеаз, 1 µL 100 мМ DTT и 75 µL экстракционного реагента Nuke Buster Reagent 2 на каждые 50 µL объема плотного осадка клеток.

Перемешивайте клетки на вортексе в течение 15 секунд на высокой скорости. Инкубируйте на льду в течение пяти минут, затем снова перемешайте на вортексе в течение 15 секунд. Центрифугируйте при 13 000 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C. После центрифугирования с помощью шприца перенесите супернатант, содержащий ядерные белки, в диализную кассету с пределом молекулярной массы 7 000 Дальтон.

Затем добавьте 500 µL 1 M DTT к 500 mL предварительно охлажденного диализного буфера и подвергните лизат диализу в течение 90 минут при 4 °C при осторожном перемешивании. Через 90 минут перенесите диализную кассету во второй стакан, содержащий 0,5 L предварительно охлажденного диализного буфера с DTT, и продолжайте диализ лизата в течение 90 минут при 4 °C при осторожном перемешивании. После завершения диализа экстракт может быть кристаллизован из-за высокой концентрации белков.

Затем вставьте новый шприц в порт, отличный от того, который использовался для инъекции в кассету, и соберите раствор диализированного ядерного белка из диализной кассеты. При извлечении раствора диализированного ядерного белка постарайтесь захватить кристаллы мутного вида. Разлейте образец по микроцентрифужным пробиркам по 20 µL в каждую, быстро заморозьте на сухом льду, а затем храните при температуре -80 °C до использования.

Определите концентрацию белка и проведите контроль качества, как описано в сопроводительном документе. Для проведения анализа с использованием молекулярных маячков разморозьте и разведите клеточные лизаты до концентрации 2 µg/µL белка с помощью базового буфера для реакции эксцизионной репарации, содержащего 1 mM DTT; разведите молекулярные маячки до 200 µM с помощью базового буфера для реакции эксцизионной репарации. Поскольку прибор для количественной ПЦР в реальном времени обычно не используется в качестве флуориметра, измените метод запуска на приборе для количественной ПЦР в реальном времени для сбора данных каждые 20 секунд при 37 °C в течение не менее 180 циклов.

Затем проводите измерения каждые 20 секунд в течение 15 циклов при максимальной флуоресценции молекулярного маяка для получения данных для нормализации. Установите объем реакции на 25 мкл. Затем настройте схему планшета на приборе с помощью соответствующего программного обеспечения биосистемы, выбрав в качестве типа эксперимента «стандартная кривая», и завершите разметку планшета.

Пример представлен в этой таблице, которая также содержится в сопроводительном документе. Не добавляйте ничего в лунку, выбранную в качестве стандартной кривой. Поместите на лед буфер для реакции эксцизионной репарации оснований, DTT, клеточный лизат в концентрации 2 µg/µL и все молекулярные маяки, используемые в эксперименте.

Затем добавьте DTT в буфер для реакции эксцизионной репарации оснований до конечной концентрации 1 мM. Пипеткой внесите по 15 µL буфера для реакции эксцизионной репарации оснований с DTT в каждую лунку подходящего оптического планшета для qRT-PCR на льду. Далее, следуя схеме расположения лунок, внесите молекулярные маячки в соответствующие лунки.

Каждую комбинацию лизата с молекулярным маячком или контролем следует анализировать в трех повторностях. В завершение внесите по 5 µL разбавленного ядерного лизата в соответствующие лунки. Важно помнить, что все реагенты для молекулярных маячков должны оставаться холодными, а внесение лизатов в планшет должно быть последним этапом.

Помните, что лизаты содержат активные белки, и они начнут восстанавливать молекулярные маяки, как только будут внесены пипеткой в реакционную смесь. Поэтому крайне важно поддерживать низкую температуру всех реагентов, чтобы минимизировать степень восстановления маяков до начала проведения измерений. После добавления всех компонентов загерметизируйте планшет оптической адгезивной пленкой и перемешайте содержимое, осторожно постукивая по планшету.

Затем выполните короткое центрифугирование в течение десяти секунд, чтобы собрать растворы на дне пробирок или планшета; после центрифугирования установите планшет в прибор для количественной ПЦР в реальном времени и запустите анализ. По завершении экспортируйте необработанные данные, предпочтительно в формате Excel, и следуйте инструкциям в прилагаемом документе для анализа данных после проведения необходимых расчетов. Постройте график нормализованных данных флуоресценции в виде процента свободного fam в зависимости от времени в секундах на диаграмме рассеяния с соответствующими погрешностями, чтобы оценить активность репарации ДНК и качество ядерных экстрактов из клеток LN 4 28 и клеточной линии с гиперэкспрессией MPG, обозначенной как LN 4 28 MPG. Анализ, описанный в данном видео, проводился с использованием молекулярного маяка, содержащего субстрат APE one tetra furin в качестве положительного контроля.

Как показано на этом рисунке, обе клеточные линии обладают выраженной активностью APE1, на что указывает крутой наклон кривой, а также ДНК-гликозилазной активностью, специфичной для удаления субстрата MPG. Содержание гипоксантина (обозначено как HX) измеряли в ядерных лизатах обеих клеточных линий. Каждый лизат анализировали с использованием либо контрольного молекулярного маяка для эксцизионной репарации оснований, либо молекулярного маяка HX для эксцизионной репарации оснований; контрольный маяк LN 4 28 показан зеленым цветом, а маяк для гипоксантина LN 4 28 MPG — пурпурным.

LN 4 28 показан синим цветом, а LN 4 28 MPG — оранжевым. Результаты представлены как A, средние единицы флуоресценции, и B, нормализованная флуоресценция. В каждой клетке наблюдалось зависящее от времени увеличение флуоресценции, что указывает на репарацию HX.

Лизат инкубировали с молекулярным маяком HX, как и ожидалось. Клеточная линия LN 4 28 MPG, обозначенная оранжевой кривой, демонстрировала гораздо более высокую скорость репарации, о чем свидетельствует более быстрое накопление флуоресценции, чем у родительской клеточной линии LN 4 28 с минимальным содержанием белка MPG. Таким образом, скорость репарации специфических повреждений ДНК специфическими белками репарации может быть измерена в экстрактах клеток в режиме реального времени с минимальным фоновым уровнем неспецифического расщепления ДНК.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как конструировать молекулярные маячки и измерять скорость репарации ДНК в режиме реального времени, используя либо очищенные белки, либо клеточные лизаты. Что касается анализа, крайне важно оценить динамический диапазон и значения фона; для этого следует включить контрольные реакции, например, с использованием положительных и отрицательных контрольных маячков или без них. Учитывая вариабельность между лунками, целесообразно нормализовать данные в отдельных лунках относительно исходных значений.

Они определяются по более точному шагу при температуре плавления. Это, наряду с добавлением других красителей, таких как эталонный краситель, позволяет нивелировать вариативность, обусловленную погрешностями пипетирования или различиями в работе детекторов. Данный метод позволил нам выяснить влияние отдельных компонентов эксцизионной репарации оснований на общую активность и способность к репарации.

Этот метод обладает достаточной чувствительностью, чтобы выявить незначительные изменения, которые невозможно было бы обнаружить с помощью традиционных методов.