Оценка изменения Печеночная Метаболический Во Прогрессивная Колонизация зародыш без мыши по ¹ Н-ЯМР-спектроскопии

Целью данной процедуры является оценка влияния прогрессирующей колонизации на печеночный метаболизм хозяина. Для этого сначала проводится постепенная колонизация безмикробных мышей. Процесс колонизации контролируют путем анализа выведения с мочой микробных кометаболитов с помощью ЯМР-спектроскопии.

После мониторинга процесса колонизации у мыши проводят биопсию печени и подготавливают образец для метаболического профилирования. Затем метаболический профиль печени может быть получен из цельного биоптата с помощью неразрушающей ЯМР-спектроскопии высокого разрешения с магическим вращением (magic angle spinning). В конечном итоге применение протонной ЯМР-спектроскопии позволяет выявить различные метаболиты, участвующие в таких метаболических путях, как энергетический обмен и пути окислительного стресса.

Таким образом, данный эксперимент позволяет получить представление о функциях печени в процессе колонизации. Этот метод также может быть применен к другим системам, например, к почкам. Для колонизации животных извлеките безмикробных мышей из изоляторов и поместите их в клетки в помещении для обычного содержания, оснастив их фильтром перед обычными животными, которые служат контрольной группой.

Затем смешайте половину трехдневного подстилочного материала, взятого из контрольной клетки с обычными животными, с подстилочным материалом гносептических (germ-Free) животных. Соберите мочу в микропробирку объемом 1.5 мл, удерживая мышь над пробиркой и способствуя мочеиспусканию путем осторожного массирования брюшной полости. Для анализа с использованием 5-мм ЯМР-зонда требуется минимум 20 µl, однако для повышения качества метаболического профилирования рекомендуется использовать 30 µl. Немедленно подвергните мочу шоковой заморозке в жидком азоте и храните при температуре не выше -40 °C до проведения ЯМР-анализа.

Перед началом ЯМР-регистрации приготовьте 0,2 М раствор натрий-фосфатного буфера на тяжелой воде с pH 7,4, содержащий 1 мМ TSP. Смешайте 30 µL мочи с 30 µL натрий-фосфатного буфера. Перенесите 50 µL полученной смеси в капиллярную ЯМР-трубку диаметром 1,7 мм с помощью стеклянного шприца объемом 50 µL, оснащенного металлической иглой.

Следите за тем, чтобы не образовались пузырьки. Установите капиллярный адаптер поверх капилляра с образцом мочи и поместите его в 2.5 миллиметровый микрокапилляр для ЯМР, предназначенный для пятимиллиметрового ЯМР-зонда. Данная комбинация трубок может использоваться как стандартная пятимиллиметровая ЯМР-трубка для регистрации спектров.

В данной демонстрации для сбора данных используется усовершенствованный трехканальный ЯМР-спектрометр Bruker с рабочей частотой 700 МГц. Снимите одномерные протонные ЯМР-спектры, используя параметры, описанные в письменном протоколе. После получения ЯМР-спектров извлеките капилляр из ЯМР-трубки диаметром 2,5 мм с помощью экстракционного стержня, аккуратно выкручивая адаптер капилляра, после проведения эвтаназии животных, как описано в письменном протоколе.

Подготовьтесь к биопсии печени. Чтобы избежать контаминации, не используйте средства, содержащие спирт; промывайте инструменты водой или физиологическим раствором. Для обеспечения воспроизводимости результатов берите биоптаты из левой доли печени.

Производите забор проб последовательно в центре левой доли, избегая периферических областей, где ткань тоньше. Будьте осторожны, чтобы не перфорировать желчный пузырь во избежание утечки желчи. Немедленно промойте ткань водой или физиологическим раствором.

Немедленно подвергните биоптаты мгновенной заморозке в жидком азоте и храните их при температуре -80 °C до проведения ЯМР-анализа. Для подготовки к H-R-M-A-S-N-M-R поместите третью биопсию в циркониевый ротор и заполните оставшийся объем чистой тяжелой водой для синхронизации (лока) ЯМР. Будьте осторожны, чтобы не допустить образования пузырьков воздуха, так как они могут ухудшить качество последующего шиммирования и сбора данных. С помощью цилиндрического винта вставьте тефлоновый спейсер объемом 50 µL.

Открутите его и откалибруйте с помощью измерителя глубины на короткой стороне. Поместите штифт с резьбой на проставку и аккуратно закрутите его отверткой. Промокните остатки воды с помощью салфетки.

Затем установите крышку на верхнюю часть ротора и вставьте его в упаковщик ротора. Плотно прижмите, пока крышка не зафиксируется на месте. Между ротором и его крышкой не должно оставаться зазоров. Отметьте черным маркером половину нижней части ротора для обеспечения возможности оптического определения скорости вращения.

После того как ротор будет достаточно плотно заполнен, поместите его в ЯМР-спектрометр и начните вращение на частоте 5 kHz. В данном случае используется спектрометр Bruker Avance III 500 MHz. Зарегистрируйте протонный ЯМР-спектр с использованием импульсной последовательности CPMG.

Согласно рекомендациям производителя, интенсивный дуплет пиков альфа- и бета-глюкозы при 5,22 ppm может быть использован для калибровки полученных спектров ЯМР. Чтобы извлечь ротор, снимите колпачок с помощью специального съемника, выкрутите стопорный винт и извлеките тефлоновую проставку. С помощью цилиндрического винта устройство можно тщательно промыть водой с моющим средством.

Появление кометаболитов кишечной микробиоты в процессе колонизации наглядно продемонстрировано на данном протонном спектре метаболического профиля мочи животного, колонизированного в течение 20 дней. В безасептическом состоянии это животное не выделяло индолилсульфат и выделяло очень небольшие количества фенилацетилглицина (сокращенно PAG) и хинолинусульфата. По мере развития колонизации уровни этих трех маркеров белкового обмена кишечной микробиотой значительно возрастают и достигают равновесия к 20-му дню.

Путем интегрирования специфического пика триплета PAG удалось количественно определить увеличение этого конкретного маркера с течением времени. На данной диаграмме представлена средняя концентрация PAG в процессе колонизации для группы из семи животных; с помощью протонной H-R-M-A-S-N-M-R спектроскопии был получен профиль метаболизма печени двух мышей до и после колонизации. Эта фигура наглядно иллюстрирует информацию, которую можно извлечь из метаболического профиля на основе A-M-A-S-N-M-R.

Может быть визуализировано множество аминокислот, а также метаболитов энергетического обмена. Эти профили также содержат информацию, относящуюся к окислительному стрессу, метаболизму нуклеотидов и метаболизму метиламина. В данном примере отчетливо видно, что у безаксильной мыши практически отсутствует гликоген и наблюдается очень низкое содержание глюкозы и триглицеридов.

Следуя данной процедуре, можно применить различные статистические инструменты, такие как хемометрика, для кластеризации биологических образцов в соответствии с метаболическим профилем и выявления биомаркеров, связанных с метаболическим статусом.