Использование МЭСМ последовательности арест как средство изолировать Рибосома связанных полипептидов

Общая цель данной процедуры заключается в выделении комплексов рибосомы 70 s, связанных с синтезируемой цепью (RNC), которые образуются в процессе трансляции в бесклеточной системе in vitro с использованием последовательности SEC TED 70. Для этого сначала к С-концевому концу интересующего гена вводится тормозящая последовательность SEC M длиной 17 аминокислот, и ген клонируется после транскрипционного промотора T7. Затем с помощью реакции транскрипции in vitro синтезируется мРНК, которая впоследствии очищается.

Затем очищенную мРНК транслируют в системе экстракта E. coli S30 с использованием радиоактивных аминокислот для мечения синтезируемого белка или растущего полипептида. Наконец, комплексы растущих цепей, связанных со вторым рибосомальным объектом Mr.Ed, выделяют методом центрифугирования в градиенте сахарозы с последующим фракционированием. В итоге с помощью гель-электрофореза меченых полипептидов, выделенных из фракций градиента, можно получить результаты, демонстрирующие стабильное связывание растущих цепей с 70 S рибосомой.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как использование мРНК с отсутствующим стоп-кодоном, является то, что он обеспечивает высокую эффективность связывания растущей полипептидной цепи с 70 S рибосомой в процессе трансляции и на последующем этапе центрифугирования. Кроме того, в отличие от технологии отсутствия стоп-кодона, данный метод может применяться с почти равной эффективностью как в системах in vitro, так и in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области трансляционного фолдинга белков, например, о том, насколько рано в процессе трансляции могут образовываться различные промежуточные формы трансляционного фолдинга, а также способствовать дальнейшему анализу их структуры с использованием прямых или непрямых методов структурного анализа.

Методы зондирования и определения. Эта методика может помочь нам расшифровать путь фолдинга белков на рибосоме. В данном протоколе мы описали выделение полноразмерных нативных цепей белка bCrystallin gamma B, связанных с 70 s рибосомой. Однако эту методику можно использовать для выделения различных вариантов практически любого интересующего белка.

Данную стратегию также можно использовать для выделения усеченных цепей нативных полипептидов дермина. Как правило, у новичков в этом методе могут возникнуть сложности на этапе центрифугирования в градиенте сахарозы, однако для опытного исследователя это не должно стать проблемой. Мы решили использовать вторую последовательность стопорирования для выделения нативных полипептидов гамма-B-кристаллина, связанных с 70S рибосомой, после первых, менее успешных попыток с использованием мРНК, лишенной стоп-кодона.

Последующий метод не позволял обеспечить стабильность RNC при последующих этапах центрифугирования с той же эффективностью, что и метод с использованием стоп-последовательности SECM. Визуальная демонстрация этого метода имеет критическое значение, так как этапы подготовки градиента и разделения RNC могут быть сложными в освоении и требуют определенного уровня квалификации для обеспечения воспроизводимых результатов. Демонстрацию процедуры проведет аспирант моей лаборатории. Для проведения транскрипции и трансляции in vitro используйте ген интереса, клонированный в любой плазмидный вектор на основе T7 и/или SP6, для генерации комплексов рибосома-начинающаяся цепь или RNC.

Удлините C-конец целевого полипептида, добавив последовательность остановки из SEC M, чтобы обеспечить выход фрагмента полипептида из рибосомального туннеля. Добавьте гибкий линкер, богатый глицином и серином, между белком и последовательностью остановки SEC M. Для подготовки к транскрипции in vitro используйте рестриктазу, которая разрезает ДНК ниже открытой рамки считывания для линеаризации матрицы. Проведите электрофорез в агарозном геле, чтобы подтвердить полное переваривание образца. После определения оптимальной концентрации ДНК используйте набор для высокоэффективной транскрипции в соответствии с инструкциями производителя для синтеза матричной РНК.

Для очистки мРНК используйте метод осаждения хлоридом лития. Затем проанализируйте образец с помощью акриламидного или агарозного геля для проверки чистоты. Для трансляции in vitro.

Используя систему E. coli в воде, свободной от нуклеаз, добавьте смесь аминокислот (1 mM) без метионина, 10 единиц ингибитора рибонуклеазы, 20 мкКи 35S-метионина, 20 мкл реакционной смеси, 24 мкл восстанавливающего буфера и 24 мкл лизата E. coli. Предварительно прогрейте реакционную смесь, инкубируя ее при 30 °C в течение пяти минут. Затем добавьте от 1 до 2 мкг мРНК и инкубируйте еще 10–15 минут при 30 °C.

Остановите реакцию, поместив ее на лед, чтобы изолировать комплексы зарождающейся цепи, связанные с 70 S рибосомой, или NCs. Нанесите реакционную смесь для трансляции поверх 4,5 мл градиента сахарозы от 5 до 30% в буфере HEPES 20 мМ, KOH pH 7,5, Mg²⁺ 15 мМ, ацетате калия 100 мМ и DTT 1 мМ. Центрифугируйте при 41 000 об/мин в течение двух часов при температуре 4 °C. После центрифугирования проведите фракционирование градиента сахарозы с помощью программируемой системы градиента плотности и детектора абсорбции, настроенного на 254 нм.

Соберите фракции, содержащие 70 s рибосомы, для дальнейшего анализа с целью определения того, остается ли белок SEC M с удлиненным C-концом прикрепленным к 70 s рибосоме. Осадите белок в каждой фракции градиента, добавив трихлоруксусную кислоту. Инкубируйте образцы в течение ночи при четырех градусах Цельсия; на следующий день центрифугируйте образцы при 14, 000 ×g в течение 15 минут для осаждения белка, затем промойте осадки смесью ацетона и 1 мМ Tris-HCl (pH 7.6) в соотношении четыре к одному.

Высушите осадок на воздухе, затем ресуспендируйте его в буфере для нанесения образцов на SDS-PAGE. Разделите образцы методом электрофореза в полиакриламидном геле с SDS в присутствии Tris-Tricine, затем зафиксируйте и высушите гели, после чего проведите авторадиографию и фосфовизуализацию, как показано здесь. После трансляции in vitro 70 S рибосомы были выделены методом центрифугирования в градиенте сахарозы и фракционирования, чтобы гарантировать, что кристаллический белок gamma B остается стабильно связанным с рибосомой.

Фракции, содержащие 70 S, объединили, подвергли обессоливанию, заменили буфер и провели дополнильный раунд центрифугирования в градиенте сахарозы. Представленные здесь результаты позволяют предположить, что SEC M может эффективно индуцировать остановку трансляции RNC с кристаллином гамма-B. После освоения данной методики процедура может быть выполнена за один рабочий день, за исключением анализа растущих цепей методом гель-электрофореза, который обычно включает этап осаждения ТСА в течение ночи.

При выполнении данной процедуры критически важно избегать контаминации РНК на любом из этапов. Загрязнение РНК может повлиять на эффективность трансляции экстракта и привести к высвобождению синтезируемого полипептида из 70S рибосомы. Следуя данной процедуре, в зависимости от конечной цели, можно получить NAST и полипептиды заранее определенной длины, стабильно связанные с 70S рибосомой.

Эти комплексы могут быть использованы для различных целей, таких как определение конформации связанных с рибосомой синтезируемых цепей с помощью прямых и косвенных методов, например, ЯМР или FRET, а также для изучения связывания факторов и лигандов после их разработки. Эта методика открыла исследователям в области структурной биологии и фолдинга белков возможность изучать конформацию полноразмерных белков, связанных с рибосомой, а также интермедиаты котрансляционного фолдинга. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как подготовить и выделить синтезируемый полипептид, стабильно связанный с 70 S рибосомой, который в дальнейшем может быть использован для поиска ответов на различные вопросы в области трансляционного фолдинга белков.

Не забывайте, что работа с радиоактивными изотопами и мечеными аминокислотами, такими как, например, A 35 methionine, требует особых мер предосторожности, которые необходимо всегда учитывать при выполнении данной процедуры.