Выносливость протокол Обучение и продольные анализы производительности для дрозофилы MELANOGASTER

Целью данного эксперимента является обучение Dsof и Melanogaster с использованием новой программы упражнений на выносливость и оценка эффектов таких тренировок. Это достигается с помощью автоматизированного устройства, которое многократно поднимает и опускает несколько пробирок с мухами, активируя их инстинктивную реакцию подъема и обеспечивая тем самым тренировочную сессию. Мухи тренируются ежедневно по нарастающему графику от двух до трех часов в течение трехнедельного периода обучения.

Затем мухи подвергаются различным поведенческим тестам для измерения эффектов физической нагрузки. Результаты показывают, что тренированные мухи поднимаются быстрее, что измеряется с помощью теста на отрицательный геотаксис (ring assay). Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как тренировки на выносливость у других животных, является наличие обширного набора инструментов для генетических манипуляций с Drosophila.

При изучении выносливости при физических нагрузках идея этого метода возникла у нас в ходе проведения многочисленных тестов на отрицательный геотаксис. Мы задались вопросом, как долго мухи могут продолжать подниматься и можно ли таким образом тренировать их выносливость. «Башня силы» (power tower) сконструирована на прямоугольном листе фанеры, который закреплен зажимами на столе.

Скорость вращения составляет 4,5 об/мин. Редукторный двигатель установлен на нескольких досках и подключен к регулятору скорости, предохранителю и выключателю питания. В распределительной коробке установлен вентилятор диаметром три дюйма, закрепленный в металлической трубке и направленный на двигатель для охлаждения.

К двигателю прикреплен вращающийся рычаг с роликом. При работе двигателя и рычага происходит нажатие на одну сторону изогнутого стержня, закрепленного на фанере. С другой стороны стержня установлен дверной шарнир, к которому прикреплено колесо, способное катиться по платформе.

Она перемещается вверх и вниз при вращении двигателя; мощность двигателя отрегулирована таким образом, чтобы полный период вращения составлял 15 секунд. На платформе с помощью эластичных шнуров закреплены штативы с пробирками для мух, а пробирки, помещенные в эти штативы, зафиксированы сеткой, которая также прикреплена к платформе. Благодаря эластичным шнурам платформа может скользить вверх и вниз по стандартным выдвижным направляющим, а пенопластовая подушка смягчает удар при ее падении. Установка «power tower» эксплуатируется в помещении с регулируемой температурой, чтобы условия соответствовали параметрам содержания животных.

Для проведения эксперимента с физической нагрузкой требуется минимум 240 самцов мух одного возраста для лонгитюдного мониторинга выносливости и способности к подъему по отрицательной геооси. Содержите мух в популяциях по 20 особей на пробирку. Разделите пробирки на две равные группы, одна из которых будет подвергаться физическим нагрузкам; пробирки этой группы должны быть закрыты пробками-флугами (flugs), в то время как пробирки контрольной группы должны быть закрыты губковыми пробками.

Для иммобилизации используется губка, так как благодаря ее адаптивному размеру ее легко разместить у дна флакона. Более мягкий материал губки также снижает вероятность травм, которые могут вызвать более твердые пробки. Флаконы с кормом следует заменять через день перед началом тестирования.

Во время обучения мухи остаются в пробирках с кормом, так как при использовании пустых пробилок многие мухи получают травмы, связанные с процессом обучения. При установке пробирок с контрольными мухами на силовую установку прижмите губчатые пробки так, чтобы они находились примерно в трех миллиметрах над уровнем корма, тем самым ограничивая перемещение мух.

Для получения воспроизводимых результатов обеспечьте постоянство условий. Тестируйте обе группы мух пять дней подряд в неделю, используя график с постепенным увеличением продолжительности сессии с двух до трех часов в день в течение трехнедельного периода. Разумеется, может быть применен любой другой режим.

Крайне важно соблюдать единообразие в подходе к обработке, времени проведения процедур и методах анализа на протяжении трехнедельного периода. Тщательное планирование и отработка процедур снижают вероятность ошибок, вызванных утомлением. Анализы можно проводить лонгитюдно на мухах до, после или во время режима тренировок.

Этот метод также может быть использован для оценки более безопасного ответа на переменную окружающей среды. Проводите тест на утомляемость в день, когда не проводятся тренировки. В начале дня поместите обе группы мух в силовую башню.

Включите аппарат и осматривайте каждую пробирку каждые 10 минут. Если в течение четырех последовательных контрольных точек пять или менее мух в пробирке поднимаются выше 2 дюймов, данная когорта мух считается утомленной. Извлеките утомленных мух из установки «power tower», пока она еще работает, и зафиксируйте время извлечения.

Наблюдайте за всеми флаконами в течение максимум 10 часов и систематизируйте результаты. Один анализ для количественного определения. Эффекты тренировки определяются путем ежедневного измерения скорости бега, которое можно проводить на протяжении всего режима тренировок и после его завершения.

Для измерения долгосрочного эффекта обучения. Чтобы начать тест на скорость подъема или тест с кольцом, сначала перенесите мух в новые пустые флаконы и поместите ряд из шести флаконов в штатив. Для закрепления флаконов в штативе используются свернутые кусочки скотча.

Затем поместите штатив перед источником света, например, перед рентгеновским просмотровым экраном, который обеспечит равномерное освещение пробирок. Установите камеру для фотографирования штатива таким образом, чтобы положение каждой мухи в каждой пробирке было отчетливо видно. После этого слегка постучите по шести пробиркам, чтобы все мухи упали на дно, и сделайте фотографию с фиксацией времени.

Через две секунды после того, как все мухи будут сбиты с ног. Если используется вспышка камеры, ее следует использовать постоянно. Повторите этот процесс четыре раза для каждого набора пробирок, прежде чем переходить к работе с системой подачи питания.

Для анализа данных оцените каждое фото индивидуально с помощью программного обеспечения, чтобы определить верхнюю и нижнюю границы флакона. Затем измерьте высоту подъема для каждой мухи. После этого скопируйте данные о высоте подъема в excel.

Каждой мухе в каждом флаконе присваивается балл от нуля до четырех, соответствующий высоте квадранта. Подъем в самый верхний квадрант оценивается в четыре балла, а отсутствие подъема — в ноль баллов. Для каждого флакона рассчитайте баллы для каждой из 20 мух и вычислите средний балл данной когорты.

Этот показатель называется индексом способности к подъему. Для анализа данных используется среднее значение четырех индексов подъема каждой когорты за этот день. Если программное обеспечение для обработки изображений недоступно, на пустых флаконах можно начертить линии квадрантов, и мухам можно вручную присваивать значения квадрантов, в то время как мухи определенного типа реагировали на протокол выносливости с менее выраженным возрастным снижением способности к подъему.

Это сохранялось и после окончания тренировок, что подтверждается результатами лонгитюдных тестов на кольце в течение пяти недель жизни. Таким образом, стимуляция физической активности с помощью программы «силовой башни» может быть использована в качестве поведенческого воздействия, что позволяет оценить способность генетических или средовых факторов модулировать этот эффект. И наоборот, «силовая башня» может использоваться и в качестве измеряемого результата.

Например, при тестировании времени до наступления утомления у мух с различным процентным содержанием сахарозы в рационе было обнаружено, что повышенное содержание сахарозы коррелировало с увеличением выносливости. При выполнении данной процедуры важно следить за тем, чтобы все когорты мух были одного возраста, а методы применялись единообразно на протяжении всего эксперимента.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить тренировки на выносливость и оценивать показатели мух любого генотипа.