Флуоресценции микроскопии Скрининг и следующего поколения секвенирования: Полезные инструменты для идентификации генов, вовлеченных в органелл Integrity

Целью данного эксперимента является идентификация гена или генов, ответственных за морфологическую и функциональную целостность органелл растений. Это достигается путем первоначального воздействия этилметансульфоната в качестве химического мутагена на семена, несущие флуоресцентный маркер органелл. На втором этапе осуществляется сбор семян от отдельных растений первого поколения мутантов для выращивания линий последующего поколения мутантов M2.

Затем семена мутагена Eliana исследуют с помощью конфокального или флуоресцентного микроскопа для выявления аберрантного органеллярного фенотипа. Заключительным этапом является получение третьего поколения мутагенов и подтверждение наличия мутантного фенотипа. В конечном итоге рецессивную мутацию можно картировать с использованием инструментов секвенирования следующего поколения.

После определения локализации мутантного гена трансформация геном дикого типа должна восстановить аберрантный органеллярный фенотип. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о поддержании морфологической и функциональной целостности органелл растений. Обработка семян Arabidopsis thaliana метансульфонатом индуцирует изменения цитозина в геноме, что приводит к переходу цитозина в тимин.

Внесение мутаций. Обработка EMS является ключевым этапом данного протокола для обеспечения оптимального соотношения мутаций у двух особей M. Для начала получите семена Arabidopsis дикого типа экотипа Columbia, которые были предварительно модифицированы для экспрессии соответствующего флуоресцентного маркера органелл.

Перенесите 0,8 грамма или примерно 40 000 семян в 50-миллилитровую пробирку типа «Falcon». Затем добавьте 25 миллилитров дистиллированной воды и 0,2% этилметансульфоната. Инкубируйте смесь в течение 16 часов на мутационном смесителе на низкой скорости; после инкубации аспирируйте жидкость и слейте ее в колбу, содержащую 1 молярный раствор гидроксида натрия.

Для инактивации EMS добавьте 25 миллилитров воды в пробирку Falcon с семенами. Закройте пробирку и пять раз переверните ее, чтобы промыть семена. После того как все семена осядут, аспирируйте воду и слейте ее в колбу с одномярольным раствором гидроксида натрия.

Повторяйте этот этап промывки до 10 раз; после финального промывания слейте семена с минимальным количеством воды. Перейдите к стерилизации семян, добавив 25 milliliters 10% отбеливателя и интенсивно встряхивая в течение 30 seconds. После того как семена осядут на дно, слейте отбеливатель и промойте их 25 milliliters стерильной воды.

После удаления стерильной воды добавьте 25 мл 70% этанола. Встряхивайте пробирки в течение 30 секунд и дайте семенам осесть на дно. Слейте этанол и промойте семена 25 мл стерильной воды.

Повторите промывку стерильной водой дважды. Затем вылейте семена в пластиковую чашку Петри с фильтровальной бумагой толщиной три мм. Дайте семенам высохнуть под вытяжным шкафом после инкубации семян в течение двух дней при температуре четыре градуса Цельсия.

Поместите семена в чашку Петри диаметром 150 мм из расчета примерно 250–300 семян на чашку с полутвердой средой Magi and scoog, содержащей фитгель (fighter gel) в качестве желирующего агента. Выращивайте семена поколения M1 на чашках в течение двух недель. Пересадите проростки в почву и дайте растениям продолжить рост.

Через 30–45 дней растения достигнут стадии зрелости, при которой признаки утечки станут отчетливо видны. На этом этапе соберите по два семени от каждого растения M1, чтобы создать 1000 независимых линий M2. Для наблюдения за проростками с помощью конфокального или флуоресцентного микроскопа вырастите по 60 семян каждой линии M2 в течение 7–10 дней на пластиковых чашках Петри в половине.

На среде Мурашиге-Скуга с добавлением фитер-геля также выращивают пять проростков неотравленного EMS контрольного образца на той же чашке. После того как проростки вырастут, на предметное стекло помещают от пяти до десяти кончиков корней, обращая сторону с печатью ABAC к объективу с 40-кратным увеличением, и накрывают покровным стеклом; при флуоресцентной микроскопии исследуют каждую клетку от кортикальной к медиальной области на предмет изменения субклеточного распределения маркера органелл. После пересадки положительных растений в почву и выращивания проростков описанным выше способом подтверждают наличие мутантного фенотипа в поколении M3.

Удалите фоновые мутации-загрязнители путем проведения не менее трех раундов обратного скрещивания с геномом дикого типа, содержащим нужный органеллярный флуоресцентный маркер, как описано в письменном протоколе. Для начала картирования используйте набор cogen DN Easy Z plant mini kit для экстракции примерно трех микрограмм геномной ДНК из линии M3, представляющей собой гомозиготную мутантную ДНК Columbia. Направьте эту ДНК на секвенирование с использованием анализатора геномов Illumina genome analyzer two 14.

Следующим шагом является скрещивание мутанта zago сорта Colombia с сортом Las Berger для получения потомства в результате последующего самоопыления, в котором может произойти данная комбинация. Полученное второе поколение в конечном итоге будет служить картированием популяцией, содержащей интересующий ген, который вызывает мутацию. Путем сравнения геномной ДНК этой популяции с геномной ДНК растений дикого типа можно определить локализацию мутации в геноме.

После выращивания растений поколения F₂ отберите от 70 до 100 особей F₂, проявляющих аберрантный фенотип, и такое же количество растений F₂ с фенотипом дикого типа; используя просекатель, вырежьте диски из листьев каждого растения. Диски следует вырезать из листьев одного и того же возраста. Чтобы обеспечить получение примерно одинакового количества ДНК, образцы можно обрабатывать для экстракции геномной ДНК по отдельности или группами.

В этом случае можно собрать от пяти до 10 образцов для каждой пробирки eend orph, чтобы сократить количество пробирок, из которых необходимо выделить геномную ДНК. Для выделения геномной ДНК используйте набор MasterPure Plant Leaf DNA Purification Kit. Затем количество геномной ДНК, полученной из каждого образца, можно определить с помощью NanoDrop.

Затем смешайте равные количества ДНК из каждого образца до достижения общего количества 300 nanograms, сохраняя образцы мутантного и дикого типов раздельно. Для подготовки к реакции мечения сначала добавьте 60 microliters раствора случайных праймеров 2,5 x и 42 microliters воды. После денатурации ДНК при температуре выше 95 degrees Celsius в течение пяти-десяти минут поместите образцы на лед для фиксации денатурированного состояния ДНК. Добавьте 15 microliters 10 X dNTPs.

Смешайте с биотинилированным DCTP и доведите объем до трех микролитров полимеразой Glen. Инкубируйте образцы в течение ночи при 25 °C.

На следующий день добавьте 15 µL 3 M ацетата натрия и 400 µL холодного 100% этанола. Инкубируйте смешанные образцы при -80 °C в течение одного часа, после чего центрифугируйте при 20 500 ×g в течение 15 минут. Промойте осадок 500 µL холодного 75% этанола, затем повторно центрифугируйте.

Высушите осадки ДНК при 37 °C в течение 10 минут. Ресуспендируйте осадки в 100 µL воды и используйте 5 µL для проверки выхода и качества на гель-электрофорезе. Реакции праймированного случайного мечения были нанесены на 1% agarose gel из пула растений F2 дикого типа и из пула мутантных растений F2.

В качестве заключительного этапа нанесите 95 мкл смеси реакции мечения дикого типа и мутанта для гибридизации с геномным чипом Arabidopsis thaliana. После сканирования полученные dot CL-файлы анализируются с помощью нашего программного обеспечения. После установки ПО откройте программу и вставьте строку Bioconductor, указанную в письменном протоколе.

Затем нажмите клавишу Enter, после чего будут установлены стандартные пакеты BIOCONDUCTOR с веб-сайта array, genotyping and mapping. Загрузите и распакуйте файлы, перечисленные в тексте, в новую папку на рабочем столе. Сохраните данные, полученные в результате эксперимента с генным чипом для дикого типа C, L и мутантного C. Теперь скопируйте данные генного чипа для дикого типа C и мутантного C в эту папку.

Затем откройте R на ПК. Нажмите «File», а затем «Change dir.». Выберите папку с файлами, нажмите «File» → «Load workspace», после чего выберите A one V five R data open read C do R. Используя текстовый редактор Notepad, скопируйте весь текст в R. Для Mac нажмите «Misc.», а затем «Change working directory».

Выберите папку, содержащую файлы. Нажмите workspace load workspace file и выберите ATH one V five R data. Аналогичным образом откройте SFP R и MAP R с помощью текстового редактора, затем скопируйте текст в консольное окно R.

Появится сообщение с предложением выполнить поиск генов в информационном ресурсе Arabidopsis или TAIR. Скопируйте и вставьте ссылку из текста в интернет-браузер. Откроется окно с запросом на открытие или сохранение файла.

Выберите «Сохранить». Укажите имя файла и добавьте расширение. Выполните команду x ls.

Затем нажмите «сохранить». Здесь представлен типичный ожидаемый результат. После анализа данных, полученных с помощью генного чипа Arabidopsis H1 genome array, на этом рисунке приведен пример картирования мутации Columbia zero с использованием генного чипа Arabidopsis H1 genome hybridization, где горизонтальные линии обозначают пороги детектирования.

Мутация в данном примере расположена на первой хромосоме и ограничена вертикальными чертами. Откройте файл dot XLS, чтобы найти координату мутанта в пределах картированной области. В собранных ридах Illumina генома мутанта выявите специфические EMS-транзиции среди однонуклеотидных полиморфизмов.

После освоения данного подхода описываемый протокол может быть использован для картирования генов в более короткие сроки по сравнению с классическим методом картирования.