Использование РНК-опосредованного вмешательства стратегии кормления для выявления генов, участвующих в размерах тела регулированию в Нематода

В данном видео демонстрируется процедура идентификации генов, регулирующих рост и размер тела C. elegans. Для инактивации генов-кандидатов с помощью РНК-интерференции (РНКи) сначала готовят чашки с бактериями, экспрессирующими двухцепочечную РНК, мишенью для которой являются интересующие гены. Гермафродитов на четвертой личиночной стадии переносят на чашки с РНКи.

После достижения стадии молодых взрослых особей их переносят на новые чашки с RNAI для откладки яиц. Через несколько часов их удаляют, оставляя синхронизированные популяции эмбрионов. На нужной стадии развития потомство собирают и монтируют на предметные стекла.

Наконец, получают микроскопические изображения червей. Анализ изображений демонстрирует изменения размера тела, вызванные инактивацией генов. Хотя данный метод может быть использован для идентификации регуляторов сигнального пути TGF beta, его также можно применять к другим путям, регулирующим постэмбриональное развитие C. elegans, таким как инсулиновый сигнальный путь.

Начните выполнение данной процедуры с клонирования целевых последовательностей генов в вектор L 4 4 4 0 A, который является широко используемым плазмидным вектором для РНК-интерференции у нематод; трансформируйте рекомбинантную плазмиду в бактериальный штамм HT one 15 DE three. Инкубируйте трансформированные бактерии на чашках с агаром LB, содержащим 25 µg/mL карбеницина и 12.5 µg/mL тетрациклина, после чего выберите один клон для дальнейшего использования.

Тем временем трансформируйте пустой вектор L 4 4 4 0 в бактериальный штамм HT one 15. Чтобы использовать их в качестве контроля для экспериментов, культивируйте трансформированные бактерии в одном миллилитре бульона LB с добавлением 100 µg/mL ампициллина в течение ночи при 37 °C.

Тетрациклин не добавляют, так как он снижает эффективность RNAI. Добавьте еще пять миллилитров бульона LB с 100 µg/mL ампициллина в ночную культуру, затем инкубируйте еще от четырех до шести часов при 37 °C. Когда культура будет готова, посейте 0,5 мл экспериментальных или контрольных бактерий на чашки с червями для RNAI, помеченные соответствующим названием клона.

Для каждого условия следует подготовить не менее двух планшетов. Инкубируйте планшеты в течение ночи при 37 °C. На следующий день.

Необходимо подготовить бактериальный газон из штаммов, экспрессирующих РНК-интерференцию с целевой последовательностью гена или без нее. Животные будут использовать бактерии в качестве источника питания. После подготовки чашек для кормления с РНК-интерференцией простерилизуйте кончик платиновой петли в пламени горелки.

Затем с помощью платиновой петли перенесите от шести до десяти гермафродитов *C. elegans* на стадии четвертой личинки (L4) на каждую чашку с РНК-интерференцией. Оставьте гермафродитов расти при температуре 20 °C в течение ночи. На следующий день животные достигнут стадии молодых взрослых особей.

Перенесите их в новый, соответствующим образом промаркированный и подготовленный планшет для РНКи. Инкубируйте планшеты при 20 °C в течение четырех-шести часов, чтобы взрослые особи могли отложить яйца. После инкубации удалите всех взрослых особей с планшета для синхронизации потомства.

После удаления взрослых особей начните отсчет времени. Это момент времени ноль. Инкубируйте планшеты при 20 °C, чтобы животные достигли интересующей вас стадии развития.

На данном этапе для фенотипического анализа будут отобраны молодые взрослые особи. Для нокдаунов, развивающихся с нормальной скоростью, требуется инкубация в течение 72 часов. Имейте в виду, что различные гены по-разному влияют на развитие животных, поэтому время инкубации может потребоваться скорректировать.

Если РНК-интерференция приводит к изменению темпов роста животных, молодых взрослых особей можно определить как тех, кто находится на стадии не более 24 часов после L4 с завершенным развитием VUL и наличием от двух до шести эмбрионов в матке, как показано здесь. Для определения других стадий развития исследователю следует ориентироваться на развитие гонад и VUL. Как только животные достигнут соответствующей стадии, приступайте к оценке фенотипов размера тела червей, подвергнутых РНК-интерференции.

Затем нанесите два слоя цветной маркировочной ленты на стеклянный предметный слайд толщиной один миллиметр, как показано здесь. Изготовьте два таких предметных стекла. После этого поместите новый предметный слайд между двумя стеклами с лентой и нанесите каплю 2% Agros, растворенного в воде.

Прижмите второе предметное стекло к центру первого, чтобы сформировать тонкую подушечку из агарозы. После застывания агарозы снимите верхнее стекло. Предметное стекло с подушечкой из агарозы готово к переносу червей.

Маркируйте предметное стекло названием клона. Нанесите 10 µL 25 mM азида натрия на подушечку aros. Затем, используя платиновую петлю, как и прежде, перенесите от 30 до 40 особей в раствор азида натрия.

Чтобы иммобилизовать животных, накройте их покровным стеклом. Проделайте это как для рекомбинантных, так и для контрольных животных L 4 4 4 0, подвергнутых РНК-интерференции. Затем поместите предметное стекло с микрометром под диссекционный микроскоп с объективом 2,5x.

С помощью программы Q Capture или аналогичного ПО сделайте снимок измерительной линейки (микрометра) и сохраните его. Затем поместите червей под микроскоп и сделайте снимки. Для начала измерения длины тела откройте изображение измерительной линейки в программе Image Pro.

Затем нажмите «measure» и выберите «calibration». Далее выберите «spatial Calibration wizard», установив параметр «calibrate the active image». Нажмите «next».

Введите название для калибровки и убедитесь, что единицы измерения пространственной привязки установлены на микроны. Затем установите флажок «Create a reference calibration» (Создать эталонную калибровку) и нажмите «Next» (Далее). Нажмите на «draw reference line» (нарисовать эталонную линию).

Появится эталонный масштабный отрезок. Переместите масштабный отрезок так, чтобы он совпадал с концами микрометра. Затем укажите, что эталон соответствует 1000 единицам.

Нажмите «ОК», затем «Далее» и «Готово». После калибровки программного обеспечения откройте изображение червя.

Затем в меню «Measure» выберите «Calibration», а затем нажмите «Select Spatial». В выпадающем меню выберите имя файла, созданного для калибровки микрометра. После этого в меню «Measure» выберите «Measurements» в открывшемся окне.

Выберите инструмент свободного рисования и с помощью компьютерной мыши проведите линию через центр тела животного от головы к хвосту. Длина будет отображена в окне. Повторите этот процесс для всех животных в поле зрения.

Экспортируйте результаты измерений длины в файл Microsoft Excel или другое подходящее статистическое программное обеспечение. Проанализируйте данные, рассчитав среднее значение и стандартное отклонение для каждого образца. Затем сравните результаты для каждой группы с помощью t-критерия Стьюдента.

Белок DBL1 суперсемейства трансформирующего ростового фактора бета (TGF-бета) необходим для активации сигнального пути TGF-бета. В ответ на активацию сигнала внутриклеточные transducers smad перемещаются в ядро и инициируют транскрипцию генов. Было установлено, что особи с нарушением работы сигнального пути TGF-бета имеют меньший размер тела, включая меньшую длину тела по сравнению с животными дикого типа.

Таким образом, проводятся скрининги C. elegans. Мутанты по размеру тела позволяют идентифицировать компоненты и модификаторы сигналинга TGF-beta для проверки эффективности РНК-интерференции (RNAi) путем кормления с целью выявления мутантов по размеру тела. RNAi использовалась для нокдауна компонентов пути DBL-1, SMA-3 и SMA-6 в четырех различных штаммах C. elegans.

Тестируемые штаммы C. elegans включали два гиперчувствительных к РНКи штамма — Lin 15 B и RF 3, а также стандартный штамм дикого типа N 2 и штамм LIN 36, чувствительность которого к РНКи аналогична N 2, как показано здесь. При нарушении экспрессии SMA 3 или SMA 6 животные имели значительно меньший размер тела по сравнению с контрольными животными, за исключением случая РНКи SMA 6 в штамме Lin 36. Фон в RF 3.

Длина тела молодых взрослых особей в контрольной группе после обработки РНК-интерференцией составила от 84 до 95% по сравнению с группой, получившей только вектор. В линии A one Lin 15 B длина тела молодых взрослых особей после РНК-интерференции составила от 68 до 86% по сравнению с контрольными животными. Однако штамм A one lin 15 B дает мало потомства.

Это делает их непригодными для крупномасштабного скрининга. Поэтому для данных методов рекомендуется использовать штамм RF three. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как идентифицировать гены, регулирующие рост и размер тела, с помощью метода РНКи-интерференции.