Микрофлюидных Смесители для изучения сворачивания белков

Общая цель данной процедуры заключается в быстром смешивании двух растворов для запуска биохимической реакции в микросекундном временном масштабе. Это достигается путем первоначального изготовления микрофлюидного смесителя. Вторым этапом является приклеивание чипа к покровному стеклу для герметизации каналов.

Затем чип устанавливается в коллектор, содержащий резервуары с растворами. Заключительным этапом является получение изображений смешанного раствора с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. В конечном итоге биохимическая реакция фиксируется в микросекундном временном масштабе путем преобразования расстояния вдоль выходного канала во время.

Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как смешивание с остановкой потока (stop flow mixing), является то, что смешивание не ограничено турбулентностью и происходит за несколько микросекунд. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области фолдинга белков, например, когда происходит гидрофобный коллапс? Процедуру продемонстрирует Линг Ву, постдок моей лаборатории, начиная с этапа изготовления микрофлюидных чипов для смешивания.

Сначала очистите четырехдюймовые кремниевые подложки FU свежим раствором пиранья, как описано в письменном протоколе, прилагаемом к данному видео. Затем с помощью печи химического осаждения из газовой фазы при низком давлении нанесите слой поликремния толщиной примерно 1 мкм на каждые 10 мкм предполагаемой глубины конечных микрофлюидных каналов. После дальнейшей обработки подложек, описанной в тексте, нанесите методом центрифугирования слой фоторезиста Z 52 14 толщиной 900 нм, затем проведите мягкий обжиг при 90 °C непосредственно на нагревательном столике в течение одной минуты или в печи при 110 °C в течение 30 минут.

После совмещения фотошаблона обеспечьте плотный вакуумный контакт, предварительно подвергнув фоторезист воздействию УФ-излучения в течение нескольких секунд. Затем проявите рисунок в фоторезисте согласно письменному протоколу. Осмотрите структуры на пластине под микроскопом и проведите окончательный запекание при 115 °C непосредственно на плитке нагрева в течение двух минут.

Затем проведите очистку пластин от органических загрязнений (DCU) в установке Asher или с помощью кислородной плазмы в течение 2.5 минут при ВЧ-мощности 100 watts. Используя установку глубокого реактивного ионного травления, полностью протравите слой поликремнезема до достижения нижележащего плавленного кварца. Удалите остатки фоторезиста и обработайте пластину в соответствии с указаниями в тексте.

Измерьте глубину травления, чтобы убедиться, что оно прошло через весь слой полимерного покрытия. С помощью установки глубокого реактивного ионного травления, подходящей для оксидов, протравите плавленый кварц на глубину примерно 10 мкм на каждый 1 мкм толщины полимерного покрытия. Очистите пластину в матричном асхере в течение четырех минут при мощности ВЧ-излучения 100 Вт и удалите поликремний с помощью установки травления дифторидом ксенона. Перед сверлением отверстий в пластине нанесите методом центрифугирования новый слой фоторезиста толщиной 1 мкм для защиты каналов при последующих манипуляциях.

Затем закрепите пластину стороной с функциональными элементами вниз на жертвенной стеклянной пластине с помощью Aqua Bond 55. Следя за тем, чтобы при склеивании не образовалось пузырьков, охлаждайте компьютерно-управляемый сверло с алмазным наконечником с использованием чистящего раствора micro 90. Это предотвратит прилипание мелких осколков стекла к каналам, что в противном случае привело бы к засорению чипа в процессе использования.

Затем просверлите входные и выходные отверстия в каждом чипе. Промойте пластину деионизированной водой, используя шприц для подачи воды в каждое отверстие. После удаления фоторезиста выдержите пластину в мыльном растворе в течение одного часа.

Нанесите резист и адгезив, как описано в тексте. Промойте пластину деионизированной водой и теплой мыльной водой. Снова промойте каждое отверстие с помощью шприца, избегая попадания на вытравленные элементы, предварительно обдув пластину азотом.

Продолжайте сушить в вакуумном oven при температуре 120 °C. Осмотрите отверстия, чтобы убедиться в отсутствии загрязнений, и при необходимости повторите этапы очистки. Следующие шаги должны выполняться в чистом помещении.

Измерьте глубину каналов с помощью оптического или механического профилометра. Очистите подложку, а также покровное стекло из плавленого кварца в чистой комнате, как описано в тексте. Тщательно просушите подложку потоком азота в течение не менее пяти минут.

Затем положите подложку функциональной стороной вверх на стопку из трех или четырех безворсовых салфеток для чистых помещений, расположенных на твердой плоской поверхности, например, на небольшом стекле. Повторите процедуру с покровным стеклом. Возьмите покровное стекло за край и переверните его так, чтобы полированная сторона была направлена вниз над подложкой.

Аккуратно совместите плоские края, опустите покровное стекло на пластину и дайте ему осесть; для корректировки совмещения допускается только горизонтальное перемещение. Надавите одним пальцем на центр пластины. Должен появиться фронт припаивания, распространяющийся от центра к краям.

При необходимости приложите дополнительное давление к другим участкам поверхности пластины для продвижения фронта сращивания. После помещения герметизированных пластин в высокотемпературную печь, запрограммированную в соответствии с температурным профилем, указанным в тексте, разрежьте пластину на отдельные чипы с помощью станка для резки пластин. Коллектор для удержания чипа смешивания и растворов может быть изготовлен из пластика, такого как лексан или оргстекло, или из алюминия.

Для контроля температуры закрепите чип на коллекторе с помощью небольших уплотнительных колец и зафиксируйте стопорным кольцом, обеспечивающим беспрепятственный оптический обзор центральной части чипа. Канавки под уплотнительные кольца должны быть менее глубокими, чем стандартные, чтобы обеспечить плотное прилегание без чрезмерного давления на чип. После установки чипа добавьте растворы в центральный и боковые резервуары, стараясь удалить все пузырьки воздуха, скопившиеся на дне лунок.

Поместите коллектор на перевернутый микроскоп и изучите область смешивания с помощью окуляра или вывода с камеры. Для обеспечения достаточного освещения установите лампу накаливания сверху на коллектор. Чтобы визуализировать струю, используйте в центральном канале краситель или раствор с высоким показателем преломления.

Поскольку объемы, используемые в этом смесителе, очень малы, поток можно контролировать с помощью давления воздуха, прикладываемого над лунками с раствором. Чтобы визуализировать струю, начните с нулевого давления в боковом канале (в фунтах на квадратный дюйм) и медленно увеличивайте его до тех пор, пока оно не сравняется с давлением в центральном канале. Если один из боковых каналов засорен, струя будет отклонена к одной из стенок выходного канала.

Если обнаружится видимый засор, его можно устранить, создав давление или вакуум в выходном канале с помощью шприца. Если чип засорен белком или другим органическим материалом, его можно очистить, выдержав в растворе Пиранья в течение ночи. Направьте сфокусированный лазерный луч в исследовательский микроскоп с помощью дихроичного зеркала, расположенного внутри или непосредственно перед микроскопом.

Отрегулируйте лазер таким образом, чтобы фокус был виден в окуляре или камере примерно рядом с областью смешивания. Флуоресценция белка в смесителе собирается объективом и проходит через дихроичное зеркало, фокусируясь с помощью линзы в отверстие (пинхол), после чего изображение фиксируется счетчиком фотонов. Просканируйте чип с помощью пьезоэлектрического сканера по осям x и y для получения изображения области смешивания.

Выберите точку на струе и выполните сканирование по осям X и Y, чтобы найти фокус в центре канала по вертикали. Глубина резкости микроскопа значительно меньше глубины канала, а скорость потока в канале однородна, за исключением области в пределах одного микрона от стенок. Таким образом, временное разрешение наблюдаемой флуоресценции определяется прежде всего размером конфокального пятна.

Выполните горизонтальное сканирование внутри выходного канала с шагом 100 микрон вдоль струи, осуществляя наблюдение в течение примерно одной миллисекунды в каждой позиции. Переместите предметный столик микроскопа на 80–90 микрон вдоль струи для регистрации данных на более поздних временных интервалах. В качестве альтернативы свет может регистрироваться с помощью спектрографа и ПЗС-матрицы после дихроичного зеркала, используя линзу для фокусировки света на входную щель.

Поскольку сбор данных происходит медленнее, чем при использовании счетчика фотонов, обычно сначала снимают изображение струи с помощью счетчика фотонов, а затем измеряют точки вдоль струи с помощью спектрографа. Данные счетчика фотонов анализируют путем суммирования трех-пяти пикселей вокруг струи в каждом положении для построения графика зависимости интенсивности от расстояния. Время рассчитывают на основе расстояния, используя значение скорости, вычисленное исходя из приложенного давления.

В качестве заключительного этапа проанализируйте данные спектрографа, используя один из методов, описанных в тексте. Здесь представлен контурный график интенсивности в области смешивания, измеренной счетчиком фотонов. Фоновый сигнал в выходном канале за пределами струи должен быть близок к уровню шума детектора и, как правило, не вычитается.

Более высокий фоновый сигнал может указывать на плохую юстировку или на то, что белок прилипает к стенкам канала. И наоборот, струя, которая выглядит искривленной или неровной, особенно в области смешивания, свидетельствует о некачественном травлении сопел. Представлен спектр с временным разрешением для белка ACell коэнзим-а-связывающего белка или A CBP, меченного Alexa 488 и Alexa 647.

Зеленым и красным прямоугольниками обозначены длины волн, соответствующие донорскому и акцепторскому каналам соответственно. Из этих данных был вычтен фоновый сигнал для удаления темнового тока и сигнала лазера. Фоновый сигнал был измерен при давлении в центральном канале, равном 0 psi.

Время смешивания можно определить путем измерения быстрой реакции, скорость которой значительно превышает скорость смешивания, например, тушения флуоресценции триптофана иодидом калия. Поскольку диаметр струи меньше оптического разрешения микроскопа, в области смешивания наблюдается значительное падение интенсивности. По мере формирования струи этот инструментальный отклик можно исключить, проведя контрольное измерение без изменения условий раствора.

На данном рисунке представлено соотношение экспериментов с перемешиванием и без перемешивания для флуоресценции N-ацетилтриптофанамида. Линия отображает расчетную концентрацию йодида калия, полученную с помощью многофизичного моделирования и симуляций в консольном режиме. Время перемешивания, измеренное как время, за которое концентрация снижается на 80%, составляет восемь микросекунд.

На этом графике показаны изменения FRET в белке A CBP после разбавления денатуранта с 6 M до 0,06 M. Эти данные не требуют проведения контрольного эксперимента. Поскольку значение FRET уже представляет собой соотношение, а отклик прибора был исключен, резкий скачок при T, близком к нулю, соответствует быстрому изменению сигнала FRET в течение времени смешивания.

После этой разработки данный метод открыл исследователям в области фолдинга белков возможность изучить самые первые этапы формирования структуры белка.