Алчность на основе взаимодействия внеклеточной скрининга (AVEXIS) для масштабируемых обнаружения низкого сродства внеклеточного рецептор-лиганд

Общая цель данной процедуры заключается в поиске новых внеклеточных белковых взаимодействий, участвующих в процессах клеточного распознавания, в частности, с участием встроенных в мембрану рецепторных белков. Метод AveXis разработан для преодоления проблемы крайне слабого сродства взаимодействий, характерного для этого класса белковых взаимодействий, а также того факта, что мембранные белки трудно подвергать биохимическим манипуляциям. Это достигается путем предварительного создания библиотеки рекомбинантных белков, представляющих собой внеклеточные области рецепторов клеточной поверхности.

Это достигается путем конструирования экспрессионных плазмид для получения эктодоменных областей рецепторов в виде растворимых фрагментов, которые используются как мономерные биотинилированные приманки и пентамерные белки-мишени с ферментативной меткой. Вторым этапом является экспрессия и нормализация белков для подготовки к скринингу взаимодействий. Все белки экспрессируются в клетках млекопитающих, чтобы обеспечить наличие таких посттрансляционных модификаций, как дисульфидные связи и гликозилирование.

Важным этапом протокола является обеспечение того, чтобы уровни всех белков-приманок (bait) и белков-мишеней (prey) в библиотеке были нормализованы до пороговых значений. Далее следует самая интересная часть — скрининг новых взаимодействий. Белки-приманки распределяются по отдельным лункам микропланшета, после чего проводится анализ их взаимодействий с белками-мишенями.

Затем проводится стадия промывки. Заключительным этапом является добавление субстрата для фермента с целью обнаружения всех захваченных белков-мишеней на массивах белков-приманок. В конечном итоге результаты VEX-скрининга позволяют определить, какие рецепторы поверхности клеток способны образовывать связывающие партнеры и, следовательно, могут быть задействованы в процессах распознавания и межклеточной коммуникации.

Основное преимущество данного метода по сравнению с популярными способами экстракции белков, такими как дрожжевая двухгибридная система или биохимическая очистка, заключается в том, что он специально разработан для обнаружения внеклеточных белок-белковых взаимодействий. Он особенно эффективен для выявления новых взаимодействий между мембранными рецепторными белками. Такие взаимодействия трудно обнаружить с помощью других методов, поскольку мембранные белки биохимически трудно поддаются манипуляциям, а их типичные взаимодействия с рецепторами-контрагентами крайне слабы.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как клетки распознают друг друга и взаимодействуют между собой. На молекулярном уровне его можно использовать для изучения фундаментальных биологических процессов, например, для определения того, какие рецепторные белки на поверхности яйцеклеток и сперматозоидов связываются друг с другом, или какие взаимодействия рецептора и лиганда отвечают за такие клеточные процессы, как слияние миоцитов или формирование нервного гребня. Основная сложность данного подхода заключается в создании библиотек белков-приманок для последующего скрининга взаимодействий.

Также очень важно убедиться, что уровни белков-приманок и белков-мишеней нормализованы в пределах пороговых значений, необходимых для проведения анализа. Это снижает частоту ложноотрицательных и ложноположительных результатов. Идея этого метода впервые пришла мне в голову во время работы над кандидатской диссертацией, когда я пытался идентифицировать партнера по связыванию для поверхностного клеточного белка CD 200.

По сути, я пытался выяснить, каков паттерн связывания для этого конкретного рецептора клеточной поверхности? Даже сегодня этот вопрос остается технически сложным для ответа. Однако в то время расшифровка генома человека была почти завершена, и я понял, что, имея полный список всех рецепторов клеточной поверхности в геноме, мы теперь можем вместо этого выяснить, какие белки из этого набора рецепторов способны взаимодействовать технически.

На этот вопрос ответить гораздо проще, и именно для этого мы разработали метод AveXis. После создания библиотеки векторов для приманок (bait) и белков-мишеней (prey) подготовьте их к трансфекции в клетки HEK 293 T. Начните с посева клеток за день до трансфекции с плотностью 250 000 клеток на миллилитр в 50 миллилитрах среды FreeStyle 293 для обеспечения эффективного биотинилирования. Добавьте D-биотин в среду, используемую для экспрессии белков-приманок, но не белков-мишеней. После подготовки всех планшетов инкубируйте клетки в течение ночи в стандартных условиях.

Поскольку биотин обладает низкой растворимостью и трудно поддается растворению, мы предпочитаем отдельно взвешивать дополнительный биотин, затем добавлять его в среду и подвергать интенсивному перемешиванию. На следующий день трансфицируют 50 мл культивируемых клеток 25 мкг плазмиды приманки или мишени, используя подходящий реагент для трансфекции, чтобы получить биотинилированные приманки. Ко-трансфекцию конструкции приманки проводят в соотношении 10:1 с плазмидами, кодирующими секретируемую форму белка биотинлигазы ELI, перед сбором образцов.

Культуры через пять дней после трансфекции обрабатывают следующим образом: сначала клетки осаждают центрифугированием при 3000 ×g в течение 20 минут, а затем супернатант фильтруют через фильтр с порами 0,22 micron. Одной из ключевых особенностей AveXis является то, что секретируемые рекомбинантные белки можно разбавлять или концентрировать до достижения пороговых значений активности. Мы обнаружили, что уровень экспрессии рекомбинантных белков варьирует в пределах четырех порядков, поэтому этап нормализации снижает вероятность появления ложноположительных результатов на этапах скрининга.

Для начала нормализации приманки из среды путем диализа необходимо удалить несвязанный дебиотин, так как он будет конкурировать с биотинилированным белком-приманкой за связывание с активными центрами стрептавидина; начните с помещения приманки в диализную трубку. Мы установили, что для обеспечения эффективного диализа рекомбинантных белков важно обеспечить избыточную площадь поверхности диализной трубки. Как правило, мы используем в два-три раза больше трубки, чем фактически требуется для диализируемого объема.

В течение 24 часов проводили тщательный диализ приманки против подходящего буфера, например PBS, после завершения процедуры диализа. Процедуру ELISA начинали с блокировки лунок микропланшета, модифицированного стрептавидином, раствором PBST с BSA в течение 15 минут. Тем временем на чистом планшете готовили серию из четырех разведений белков-приманок от 1:1 до 1:3 в PBST с 2% BSA.

После 15 минут инкубации перенесите разведение на планшет, кодированный стрепто-TTR, и инкубируйте планшет в течение одного часа при комнатной температуре; по истечении часа промойте лунки, а затем в каждую лунку добавьте 100 µL OX 68 в концентрации 2 µg/mL. Инкубируйте планшет при комнатной температуре еще один час. После второй инкубации проведите еще одну серию промывок и заполните лунки планшета анти-US щелочной фосфатазой.

Инкубируйте планшет в течение третьего часа при комнатной температуре. Затем промойте планшет трижды в PBST и проведите финальную промывку в PBS. Для удаления остатков детергента через час добавьте 100 µL субстрата 1 0 4 в концентрации 1 mg/mL в буфере диэтаноламина.

При комнатной температуре измерьте оптическую плотность при 405 нм. Серия разведений четырех различных диализированных супернатантов с приманкой была проанализирована методом ELISA с использованием моноклонального антитела к тегу CD4. Если концентрации неразбавленных экспрессированных белков-приманок недостаточно для насыщения всех сайтов связывания биотина на планшете, покрытом стрептавидином, сконцентрируйте белок с помощью концентратора Viva spin. В противном случае используйте белок-приманку в разведенной концентрации в PBST с 2% BSA.

Этого количества достаточно для насыщения сайта связывания биотина в данном анализе. Определите относительные уровни экспрессии предшественников белков, используя активность фермента бета-лактамазы. Начните с приготовления серии разведений супернатанта, содержащего парапротеины, в буфере PBST с 2% BSA.

Затем добавьте 20 µL разведения к 60 µL раствора нитрозного степина, внесенного в планшет. Немедленно перенесите планшет в планшетный ридер и измеряйте оптическую плотность при 485 нм каждую минуту в течение следующих 20 минут, используя центрифужные концентраторы или разведение в PBST с 2% BSA. Установите конечную концентрацию образцов так, чтобы гидролиз всех нитроз в анализе происходил примерно за семь минут, что соответствует примерно двум оборотам нитроз в минуту.

Начните скрининг AveXis с промывки планшета с покрытием strep TAVR ENC в растворе PBST, после чего удалите излишки жидкости, прижав планшет к бумажному полотенцу. Затем добавьте в каждую лунку PBST с BSA и инкубируйте планшет в течение 30 минут. Это позволит заблокировать участки неспецифического связывания белков.

Из каждой лунки удалите блокирующий раствор, резким движением наклонив планшет над раковиной, и добавьте по 100 µL нормализованного биотинилированного мономерного белка-приманки в соответствующие лунки. Инкубируйте планшет в течение одного часа при комнатной температуре. Затем удалите образцы приманки из планшета аналогичным движением и трижды промойте его раствором PBST.

Затем промокните лунки насухо после третьей промывки. Теперь добавьте по 100 µL нормализованной конструкции-мишени пентамера в каждую лунку и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение одного часа. По истечении часа промойте планшет еще три раза раствором PBST и один раз — только раствором PBS.

Наконец, добавьте по 60 µL раствора нитро-белого в каждую лунку и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение двух часов или, что предпочтительнее, инкубируйте планшеты в течение 16 часов при 4 °C. На следующий день положительные взаимодействия окрасятся в красный цвет. Сфотографируйте планшет для визуальной фиксации результатов, а затем количественно определите интенсивность реакций по оптической плотности при 485 nm с помощью планшетного ридера.

Примерно через 10 минут после начала screening-реакции AveXis наблюдалось изменение цвета с желтого на красный как в контроле захвата добычи, опосредованном антителами, так и в контроле положительного взаимодействия. Это изменение цвета указывает на гидролиз нитрозного субстрата. Некоторые положительные взаимодействия наблюдаются в этот промежуток времени, однако большинство из них проявляются через несколько часов.

Как правило, наблюдается частота обнаружения хитов примерно от 0,4 до 0,6% положительных результатов. После подготовки библиотек белков этап скрининга в данной методике может быть выполнен быстро. После выявления взаимодействия вполне возможно проводить скрининг до 12 планшетов в день.

Самым важным следующим шагом является, во-первых, подтверждение того, что взаимодействие может быть воспроизведено с использованием новых независимых препаратов белков. Во-вторых, мы всегда определяем, не зависит ли взаимодействие от ориентации «приманка-мишень», то есть может ли оно быть взаимным. Это предполагает клонирование доменов вектора приманки в вектор мишени и наоборот.

Взаимодействия, которые могут быть повторены и являются взаимными, считаются высокодостоверными и всегда оказывались положительными. Для дополнительной валидации любых повторно выявленных взаимодействий мы предпочитаем использовать такие методы, как поверхностный плазмонный резонанс. Важно отметить, что это позволяет продемонстрировать способность двух очищенных компонентов взаимодействовать напрямую, а также показать, что связывание является насыщаемым и, следовательно, специфическим.