Анализируя сотовой Интернализация наночастиц и бактерий нескольких спектральных изображений проточной цитометрии

Для анализа клеточных механизмов интернализации наночастиц и бактерий с помощью мультиспектральной проточной цитометрии с визуализацией макрофаги предварительно обрабатывают цитохалазином D для ингибирования полимеризации актина. Затем к монослою макрофагов добавляют наночастицы или salmonella и инкубируют.

Затем макрофаги собирают, фиксируют и маркируют для анализа с помощью системы потоковой визуализации. Мультиспектральный имидж-цитометр позволяет отличить клетки, интернализировавшие наночастицы и/или salmonella, от клеток, на поверхности которых находятся наночастицы и/или salmonella. Полученные данные свидетельствуют о том, что salmonella и наночастицы интернализируются только теми клетками, которые не подвергались обработке cyto klain.

D, что указывает на актин-зависимый характер интернализации. Данный метод обладает несколькими преимуществами по сравнению с существующими методами, такими как проточная цитометрия и конфокальная микроскопия. Прежде всего, он обеспечивает точное измерение интенсивности флуоресцентного сигнала и пространственное разрешение между различными клеточными структурами при высокой скорости анализа.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы как в области исследований биоматериалов для вакцин и систем доставки лекарств, так и в исследованиях взаимодействия патогенов с организмом хозяина. Сюда входит определение путей интернализации, используемых полиангидридными наночастицами и бактериями. Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, часто сталкиваются с определенными трудностями.

Важно уделить время титрованию красителей для получения оптимальных сигналов флуоресценции. Кроме того, определенное время требуется на освоение программного обеспечения и создание шаблонов анализа. Идея данного метода возникла у нас, когда при использовании микроскопии и других методов было обнаружено, что полигидронаночастицы проявляют характеристики, имитирующие патогены.

Затем нам потребовалась высокопроизводительная система для сравнения процессов интернализации, используемых salmonella и наночастицами гидрида пыльцы, перед проведением анализа. Все культуры клеток млекопитающих и бактерий должны быть собраны, а суспензии наночастиц — подготовлены. Начните со сбора конфлюэнтных клеток RAW 264.7 с помощью скребка для клеток.

Определите количество клеток с помощью гемоцитометра. Затем высейте клетки в 24-луночный культуральный планшет с плотностью 5 × 10⁵ клеток на лунку в 0,5 мл среды. Дополните среду DMEM и инкубируйте в течение ночи при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2.

Для подготовки суспензии Salmonella tarica разведите Salmonella в среде C-D-M-E-M, чтобы получить множественность заражения 100 на клетки RA W2 64.7, в стеклянной культуральной пробирке с автоклавируемой завинчивающейся крышкой размером 16×125 мм. Затем, используя стерильную фильтровальную бумагу, отвесьте 5 мг полиангидридных наночастиц, нагруженных 1% FITC (синтезированных согласно описанию коллег Rean в публикации 2009 года в журнале Pharmaceutical Research), в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте наночастицы в 0,5 мл холодного фосфатно-солевого буфера и поместите пробирку на лед.

Держите пробирку на льду. С помощью ультразвукового гомогенизатора с микронасадкой подвергните суспензию соникации в течение примерно 25 секунд при энергии от четырех до шести джоулей. Теперь, когда все необходимые клетки и реагенты подготовлены, можно приступать к проведению анализа фагоцитоза.

Промаркируйте 24-луночные планшеты для культивирования тканей, содержащие культуру клеток RA W2 64.7, в preparation к анализу на первой планшетке. Каждое из следующих образцов будет проанализировано в трех повторностях: клетки с cyto и D с наночастицами, клетки с cyto и D с salmonella, среда с наночастицами, среда с salmonella, только наночастицы, только salmonella и клетки, окрашенные AF six 60. Контроли при 4 °C будут проанализированы на второй планшетке и будут включать среду плюс наночастицы и среду плюс salmonella; инкубация при такой низкой температуре замедляет клеточные процессы, такие как фагоцитоз. За один час до индукции добавьте 5 µg/mL cyto и D в C-D-M-E-M в соответствующие лунки и инкубируйте клетки при 37 °C.

После инкубации перемешайте суспензию наночастиц на вортексе и добавьте по 10 µL в соответствующие лунки. Затем перемешайте суспензию salmonella на вортексе и добавьте ее в соответствующие лунки при MOI 100. Несколько раз аккуратно постучите по планшету для перемешивания.

Затем поместите планшеты с образцами при 37 °C, а планшеты с отрицательным контролем — при 4 °C на 45 минут. После инкубации поместите планшеты на лед и дважды промойте клетки ледяным PBS без кальция и магния, аспирируя и удаляя старую среду для вымывания несвязавшихся частиц, сальмонеллы, а также погибших или открепившихся клеток. Использование petal магния.

Предварительная обработка PBS на данном этапе необходима, так как она облегчает отделение клеток от субстрата. Для сбора клеток добавьте 250 µL ледяного PBS и осторожно соскоблите содержимое лунок, перенесите собранные клетки пипеткой в силиконизированные микроцентрифужные пробирки с защелкивающейся крышкой и храните их на льду. Промойте клетки, добавив 1 mL холодного промывочного буфера, затем центрифугируйте при 250 ×g в течение 10 минут при 4 °C. После удаления супернатанта удалите остатки буфера, постукивая перевернутой микроцентрифужной пробиркой по бумаге.

Ресуспендируйте осадок клеток, осторожно перемещая микроцентрифужную пробирку по штативу для пробирок. Для фиксации клеток добавьте 100 µL 4% параформальдегида в PBS и выдержите клетки в течение 15 минут. При комнатной температуре промойте клетки, добавив 1 mL буфера для промывки Perm, затем центрифугируйте при 250 ×g в течение 10 минут при 4 °C.

После удаления супернатанта удалите остатки буфера, как было описано ранее. Затем приступайте к окрашиванию клеток RA W2 64.7. Для окрашивания актина добавьте 100 microliters буфера для промывки с пермеабилизатором, содержащего Alexa Fluora foid в six 60, на 15 minutes.

При комнатной температуре неокрашенные образцы следует инкубировать с пермом, промывочным буфером без фина. После окрашивания клетки необходимо снова промыть и центрифугировать, затем ресуспендировать их в 50 µL PBS, содержащего 1% PFA, и хранить в темном месте при температуре 4 °C до начала сбора данных. Включите питание, запустите поток изображений и начните работу.

Выполните вдох и инициализацию гидравлической системы в меню «Файл». Выберите «Загрузить шаблон по умолчанию». В галерее изображений через меню «Вид» выберите «Выделить все» и нажмите «Запустить настройку» (run setup), чтобы начать визуализацию микросфер; при необходимости отрегулируйте отслеживание ядра (core tracking) для центрирования изображений по горизонтали.

Выберите канал светлого поля и нажмите «set intensity». Дождитесь, пока коэффициент вариации скорости потока стабильно будет составлять менее 0.2%. На вкладке «assist» нажмите «start all», чтобы запустить калибровки и тесты, и убедитесь, что в программном обеспечении все они прошли успешно. Нажмите «load sample».

Затем, следуя инструкциям, установите пробирку с самым ярким образцом. Когда все флуорохромы будут находиться в загрузчике образцов, выберите 40-кратное увеличение. После установки параметров прибора не изменяйте их на протяжении всего эксперимента.

Включите каждый лазер, используемый в эксперименте, нажав на соответствующие иконки лазеров в программном обеспечении, и установите мощность лазера таким образом, чтобы максимальные значения пикселей для каждого флуорохрома находились в диапазоне до 104 000 импульсов (counts), согласно измерениям на диаграммах рассеяния. Чтобы исключить сбор ненужных объектов, откройте окно классификатора клеток в программе. Затем, чтобы собирать данные только по клеткам, выберите нижний предел площади для первого канала светлого поля и установите значение 50 µm; объекты с площадью менее 50 µm будут считаться дебрисом и не будут зарегистрированы.

Выберите каналы для сбора данных, нажав на соответствующие значки каналов в программном обеспечении. На вкладке настроек (setup) выбраны каналы 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Введите номер файла и папку назначения.

Установите номер последовательности на один, а количество собираемых событий — на 5 000. Нажмите «Run, acquire», чтобы собрать и сохранить файл данных первого эксперимента. Нажмите «FLL» и запустите анализ следующего экспериментального образца.

Повторяйте процедуру до сбора всех экспериментальных образцов. Затем для запуска контрольных измерений нажмите на comp settings. Это отключит светлое поле и рассеивающий лазер, а также активирует сбор данных по всем каналам флуоресценции во вкладке acquire.

Измените входное значение на 500. Затем установите контрольную пробирку и нажмите «run». Выполните сбор данных для получения 500 положительных клеток в контролях с одиночным окрашиванием.

Повторите процедуру для каждого флуорохрома, используемого в эксперименте, чтобы создать компенсационную матрицу. После получения всех изображений образцов запустите программное обеспечение для анализа ideas на отдельном аналитическом компьютере, дважды щелкнув по иконке ideas на рабочем столе. Дважды щелкните по мастеру интернализации (internalization wizard) и загрузите один из RIF-файлов тестового образца.

В сплывающем окне появятся инструкции по загрузке тестовых файлов. Следуйте инструкциям и нажмите кнопку «Далее». Затем нажмите «Новая матрица».

Это запустит мастер компенсации. При появлении соответствующего запроса выберите файлы данных для одноцветных контролей, чтобы добавить их. Нажимайте «Далее» в мастере, следуя инструкциям, пока файл матрицы компенсации не будет сохранен и загружен в поле на втором этапе мастера интернализации.

Нажимайте «Далее» и следуйте инструкциям до тех пор, пока не будет создан файл DAF. Настройте свойства отображения изображения, выбрав каналы изображения, которые использовались при сборе данных. Выберите канал два для FITC и канал пять для AF 660.

По умолчанию выбраны светлое поле и боковое рассеяние. Выберите канал светлого поля O1 для определения границ клеток и канал O2, в котором собирались наночастицы или бактерии (внутренний зонд), чтобы определить популяцию одиночных клеток; после этого будет построен график зависимости площади светлого поля от коэффициента формы всех клеток. Высокопроизводительный анализ нескольких файлов данных требует наличия файла-шаблона, поэтому при создании такого шаблона крайне важно тщательно определить гейты.

Каждая точка представляет значения для отдельного изображения клетки. Нажмите на точку на графике, чтобы выбрать изображение этой конкретной клетки в галерее изображений.

Затем выделите гейтом клетки, площадь и коэффициент формы которых соответствуют одиночным клеточным событиям. Одиночные клетки имеют коэффициент формы около одного, в то время как дуплеты — около 0,5.

Нажмите на несколько клеток, чтобы разграничить область, содержащую одиночные клетки, и область с дуплетами или детритом. Чтобы построить гистограмму среднеквадратичного значения градиента изображения в светлом поле, нажмите кнопку «Далее».

Затем на вкладке population выберите опцию bin для отображения выбранного бина. Нажмите на бины, чтобы определить положение клеток и наилучший фокус. Нажмите «Begin» и нарисуйте линейную область, чтобы выделить сфокусированные клетки.

Чем выше среднеквадратичное значение (RMS) градиента, тем лучше фокусировка; пропустите следующий шаг, если нет других красителей для гейтирования. Строится новый график рассеяния, где по оси X отложена интенсивность второго канала, а по оси Y — максимальное значение пикселя второго канала. Нажимайте на точки и просматривайте изображения, чтобы определить область для выделения клеток, положительных по наночастицам или бактериям.

Построена гистограмма признака интернализации с областью, начинающейся с нуля, которую следует скорректировать при просмотре изображений. Признак интернализации представляет собой отношение интенсивности внутри клетки к интенсивности всей клетки. Он масштабирован таким образом, что при значении ноль половина интенсивности находится внутри.

С помощью мастера для каждой клетки была создана область, обозначающая внутреннюю часть; для этого была создана маска, которая использовалась вместе с входным изображением клетки для поиска поверхности клетки, после чего маска была сужена (эродирована) на четыре пикселя. Обратите внимание, что при необходимости эту маску можно отредактировать вручную для разных типов клеток, сначала создав маску объекта на изображении в светлом поле, а затем сузив её на большее или меньшее количество пикселей. Параметр интернализации рассчитывается на основе этой суженной маски объекта с использованием алгоритма, встроенного в программное обеспечение.

Эта функция позволяет нам отличать интернализованные частицы и бактерии, большая часть флуоресцентного сигнала которых находится внутри границы маски, от частиц и бактерий, связанных с поверхностью, основная часть сигнала которых находится за пределами границы маски, как показано в данном примере; создайте новую гистограмму с новым признаком интернализации на основе эродированной маски объекта. Выделите область для гейтирования интернализованных клеток, просматривая изображения в режиме выбранного бина. Установите значение гейта на 0,3. Здесь.

Клетки с показателем ниже 0.3 считаются позитивными по количеству частиц, связанных с поверхностью. Чтобы исключить клетки с фоновым окрашиванием и идентифицировать специфически интернализованные наночастицы или бактерии, выберите соответствующие параметры в меню анализа. Нажмите на меню анализа.

Затем нажмите на функцию подсчета событий (spot count), чтобы добавить среднее количество событий в статистический отчет. В меню отчетов нажмите на иконку отчетов. Затем выберите «статистический отчет» (statistics report), нажмите «добавить столбцы» (add columns) и выберите соответствующую популяцию клеток.

Нажмите «ОК». Мастер интернализации автоматически добавит статистику в этот отчет, чтобы сохранить файл данных в качестве файла-шаблона для пакетного анализа всех экспериментальных файлов. Откройте меню «Файл» и выберите «Сохранить как шаблон».

Шаблонные файлы. Имеют расширение .AST для анализа нескольких файлов данных в программном обеспечении IDEA. Нажмите Tools и выберите Batch Data Files, затем введите все RIF-файлы.

Добавьте файл матрицы компенсации и файл шаблона в соответствующие разделы, чтобы отправить пакет на обработку, затем нажмите кнопку «submit». После этапа обработки все файлы RAF анализируются, и для каждого из исходных файлов генерируются файлы DAF. Формируется итоговый отчет со статистикой по всем образцам для сравнения влияния ингибирования актина и низкой температуры на фагоцитоз salmonella и наночастиц.

Клетки RA W2 64.7 инкубировали при 37 °C в среде, либо с добавлением Cytochalasin D, либо без него, а также инкубировали в среде при 4 °C. Как воздействие температуры, так и манипуляции с актином привели к снижению интернализации как наночастиц, так и Salmonella. Однако инкубация клеток с Cytochalasin D увеличила процент клеток с наночастицами, связанными с поверхностью, и одновременно снизила процент клеток с Salmonella, связанными с поверхностью.

Процент клеток с наночастицами, связанными с поверхностью, увеличивается примерно с 8% при 37 °C до более чем 35% после обработки цитохалазином D или при температуре 4 °C. Напротив, процент клеток со связанными на поверхности salmonella снизился с 35% до 15% после обработки цитохалазином D. Инкубация клеток RAW 264.7 с salmonella при 4 °C привела к снижению интернализации без явного увеличения количества связанных с поверхностью бактерий по сравнению с контролем при 37 °C. В совокупности эти данные демонстрируют, что salmonella и наночастицы интернализируются посредством схожего клеточного процесса, который зависит от температуры и требует участия актина.

Кроме того, данные указывают на то, что для устойчивого прикрепления salmonella к макрофагам требуется полимеризация актина. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как исследовать клеточную интернализацию наночастиц и бактерий с помощью мультиспектральной проточной цитометрии с визуализацией. При выполнении данной процедуры важно помнить, что ингибиторы обладают цитотоксичностью.

Следовательно, необходимо предварительно провести эксперименты по профилированию цитотоксичности для определения оптимальных рабочих концентраций. Помните, что работа с salmonella может быть опасной; при выполнении данной процедуры следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование соответствующих средств индивидуальной защиты и предотвращение образования аэрозолей.