Оптимизирован анализ метилирования ДНК и экспрессии генов с малым, Анатомически определенных областях мозга

Общая цель данной процедуры — изучить изменения метилирования ДНК и экспрессии генов при стрессе в раннем возрасте. Для этого сначала новорожденные мышата подвергаются сепарации от матери для индуцирования стресса в раннем возрасте, а на втором этапе интересующие области мозга, в данном случае PVN, извлекаются путем микродиссекции in loco, после чего из одного образца ткани одновременно выделяют ДНК и РНК.

Затем полученную ДНК обрабатывают сульфитом, а целевой участок амплифицируют с помощью бисульфитной ПЦР. После этого продукт лигируют в вектор и трансформируют в бактерии. Успешные трансформации определяют по экспрессии маркера и размеру ПЦР-фрагмента.

И наконец, для оценки статуса метилирования используется бисульфитное секвенирование. Основным преимуществом данного рабочего процесса является возможность удобного анализа эпигенетического программирования в ответ на воздействие факторов окружающей среды. Этот метод позволяет получить представление об эпигенетическом программировании, вызванном неблагоприятными условиями в раннем возрасте.

Данный метод также может быть применен к другим системам в случаях, когда анализ метилирования и экспрессии генов проводится в условиях высокой тканеспецифичности или когда доступность тканей ограничена. Для индукции стресса в раннем возрасте у потомства самок линии C 57 black six N с фиксированным сроком беременности проводится процедура разделения с матерью.

Перемещайте каждое помещение в подогреваемую чистую клетку на три часа ежедневно с 1-го по 10-й постнатальный день; контрольных щенков, не подвергавшихся стрессу, не беспокоить. За исключением трехчасового разделения, все помета остаются с матерями до отъема на 21-й постнатальный день. Затем щенков расселяют по группам одного пола по три–пять мышей в клетке в стандартных условиях содержания. Для начала сбора тканей мозга извлекают мозг мыши из черепа, немедленно замораживают в сухом льду и хранят при температуре -80 °C.

Когда наступит время сбора тканевых кернов, извлеките мозг из морозильной камеры при -80 °C и поместите его на сухой лед. Начните с криосекционирования мозга на корональные срезы толщиной 10 micron в направлении от рострального к каудальному концу. Закрепите срезы на стеклах Superfrost и высушите их для окрашивания кристаллическим фиолетовым.

Дополнительные срезы можно подготовить и хранить при -20 °C для дальнейших анализов, таких как гибридизация in situ. Когда наступит время для забора проб, окрасьте срезы кристаллическим фиолетовым, чтобы идентифицировать интересующие структуры мозга. Затем с помощью просекателя возьмите пробы диаметром 0.8 mm из интересующих областей, используя микродиссекцию in loco.

Биоптаты следует хранить при температуре -80 °C. Крайне важно выполнять микродиссекцию стандартизированным образом, так как экспрессия и метилирование генов обладают высокой тканеспецифичностью. Гомогенизируйте биоптаты в 400 µL буфера с тиоцианатом гуанидина с помощью пипетки, затем перемешайте на вортексе при комнатной температуре.

Затем пропустите полученный лизат через шприц с иглой 29G. Повторите процедуру несколько раз, пока частицы ткани не перестанут быть видимыми. Разделите лизат на равные части.

Один набор предназначен для обработки РНК, которую следует обрабатывать в первую очередь, а другой — для обработки ДНК, которую можно хранить при комнатной температуре до завершения обработки РНК. Для очистки РНК используют одну 1/10 часть объема ацетата натрия, один объем водного фенола и половину объема смеси хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 24:1. После каждого добавления смесь интенсивно перемешивают на вортексе, а затем полученную пробу инкубируют на льду в течение 10 минут. После этого смесь центрифугируют.

Соберите водную фазу и добавьте к ней равный объем 70% этанола. Используя набор со спиновыми колонками для очистки РНК, проведите переваривание ДНК непосредственно в колонке, выполните промывку и элюируйте РНК в 25 µL воды.

Теперь очистите ДНК, используя протокол набора, модифицированный с учетом добавления стадии расщепления РНК, а также предварительного нагрева буфера для элюции и колонки для элюции до 70 °C перед их использованием. Для колонок достаточно 10 минут при 70 °C. В завершение используйте спектрофотометр для определения концентраций ДНК и РНК.

Типичный панч ПВЯ дает около 600 нанограммов ДНК и около 400 нанограммов РНК; при этом около 100 нанограммов РНК откладывают для анализа экспрессии генов с помощью количественной ПЦР перед амплификацией после бисульфитной конверсии. 200 нанограммов выделенной ДНК обрабатывают с помощью коммерчески доступного набора для амплификации ДНК из метилированных участков. Закажите праймеры, разработанные специально для бисульфит-конвертированной ДНК. Оптимальный дизайн праймеров для бисульфитной ПЦР имеет решающее значение, так как качество и специфичность ПЦР-ампликона определяют успех последующих этапов.

После получения праймеров определите их оптимальную температуру отжига с помощью пилотных экспериментов. В качестве матрицы для каждой 25 µL ПЦР-смеси используйте 2 µL ДНК, обработанной бисульфитом.

Проведите амплификацию смеси, начав с денатурации в течение шести минут при 95 °C, затем выполните от 45 до 50 циклов амплификации и завершите процесс финальной элонгацией в течение пяти минут при 72 °C. Проанализируйте семь µL продукта ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле для проверки размера ампликона. Очистите оставшийся продукт ПЦР для последующего лигирования, используя имеющийся в продаже набор для очистки продуктов ПЦР.

Если в результате ПЦР были получены нежелательные продукты, используйте очистку в геле для выделения целевого продукта для данного протокола. Применяется коммерческий набор для клонирования. Эффективность клонирования критически зависит от вставки.

Таким образом, если количество рекомбинантных клонов систематически остается низким, попробуйте использовать другой вектор клонирования. Поставьте реакцию лигирования в объеме 10 µL, используя 1 µL вектора и 3 µL очищенного ПЦР-продукта. Перемешайте реакционную смесь пипетированием и инкубируйте ее в течение ночи при температуре 4 °C.

Очистите реакционную смесь лигазирования методом классического осаждения этанолом и трансформируйте бактерии полученным продуктом. Сразу после подачи импульса добавьте один миллилитр предварительно подогретой среды SOB и перенесите трансформированные бактерии в реакционную пробирку. После восстановления бактерий в течение одного часа при 37 °C высейте по 100 µL каждой суспензии на чашку с LB-агаром, ампициллином и IPTG.

Инкубируйте чашки с Xal в течение ночи, пока не появятся колонии, пригодные для отбора. Подготовьте ПЦР-реакции с колониями в объеме 25 µL в 96-луночном планшете, добавив в каждую реакцию 3 µL 2.5 mM хлорида магния. Отберите положительные белые клоны с помощью наконечника пипетки и перенесите их в ПЦР-смесь, просто погрузив наконечник в колонию.

Начните ПЦР с цикла плавления длительностью четыре минуты. Затем проведите 10 циклов амплификации с температурой отжига 56 °C. Продолжительность каждого этапа этих циклов составляет 30 секунд.

Затем снизьте температуру отжига до 48 °C еще на 30 циклов амплификации. Завершите процесс пятиминутным циклом элонгации. Теперь нанесите по 5 µL каждого продукта на агарозный гель и определите реакции, содержащие вставку подходящего размера.

Используйте имеющийся в продаже набор для очистки целевых продуктов ПЦР с целью их последующего секвенирования методом циклического секвенирования с терминаторами BigDye. В планшет на 96 лунок внесите в каждую лунку 3 µL мастер-смеси для реакции BigDye, а затем 2 µL очищенного продукта ПЦР колоний. Проведите реакцию в термоциклере, начав с 1 мин при 96 °C, с последующими 35 циклами: 10 с при 96 °C, 5 с при 50 °C и 4 мин при 60 °C.

После завершения реакции бисульфитного преобразования очистите реакционную смесь с помощью плато для бисульфитной очистки. После получения последовательностей проанализируйте их с помощью онлайн-анализатора бисульфитов или инструмента B-I-S-M-A, чтобы определить паттерн метилирования исследуемого участка ДНК и понять влияние стресса в раннем возрасте (ELS) на экспрессию и статус метилирования avp. Мыши линии C57BL/6 обрабатывали согласно описанному протоколу; проводили вырезание образцов из паравентрикулярного и супраоптического ядер для выделения ДНК и РНК. ДНК подвергали бисульфитной обработке и амплифицировали с помощью праймеров, специфичных к энхансеру avp; продукты ПЦР клонировали и секвенировали, используя не менее 20 рекомбинантных клонов от каждой мыши.

Результаты ПЦР были проанализированы для определения частоты метилирования CpG-островков, содержащихся в ПЦР-ампликоне тканей; было установлено, что P-V-N-E-L-S индуцирует значительное гипометилирование в четырех локусах энхансера A VP, что указывает на эпигенетическое маркирование этого регуляторного региона под влиянием опыта раннего развития. В отличие от PVN, метилирование энхансера A VP в SON не подвергалось влиянию ELS, что демонстрирует тканеспецифичность эпигенетического эффекта. У контрольных животных статус метилирования ДНК в CpG 10 отрицательно коррелировал с экспрессией гена a VP, что указывает на роль метилирования ДНК в тонкой настройке экспрессии этого гена. После данной процедуры на выделенной РНК можно легко провести другие методы, такие как UPCR, для получения ответов на дополнительные вопросы, например, об изменениях экспрессии генов в анализируемой ткани.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изучать изменения метилирования ДНК в ответ на стимулы окружающей среды или опытную зависимость.