Ретроградная Загрузка нервов, урочища, и корешков спинного мозга с флуоресцентными красителями

Общая цель данной процедуры заключается во введении высокой концентрации флуоресцентного или ион-чувствительного красителя в нейроны или любой нейрональный тракт с использованием простого и недорогого метода. Это достигается путем предварительного изготовления двух типов пипеток: типа один и типа два. Затем к пипетке типа один подсоединяют гибкую эластомерную трубку и подают положительное давление, чтобы затянуть целевой нейрональный тракт в пипетку типа один, убедившись в создании герметичного соединения.

Затем вставьте пипетку второго типа в пипетку первого типа и с помощью пипетки второго типа аспирируйте остатки A CSF из пипетки первого типа. После этого введите краситель в пипетку первого типа, стараясь не допустить появления пузырьков воздуха. Заключительным этапом является инкубация нейронов в темноте от 6 до 20 часов.

В конечном итоге, после извлечения пипетки первого типа, препарат готов к исследованиям in vitro, электрофизиологическим или морфологическим исследованиям. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как аппликация в ванну, инъекция в BOS и электропорация, является доставка D в определенную популяцию нейронов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейронаук, касающиеся активности, связности, морфологии и распределения определенных нейронов.

Как правило, эта методика требует практики, особенно в части предотвращения разбавления красителя в пипетке первого типа и недопущения попадания в нее пузырьков воздуха. Начните процедуру с вытягивания полиэтиленовой трубки над пламенем спиртовой лампы для получения двух коротких пипеток с коническими кончиками. Сначала вытяните короткую пипетку первого типа с узким кончиком, который сможет плотно фиксировать целевой корень или тракт.

Затем возьмите пипетку второго типа с более длинным и тонким стержнем и очень узким кончиком, которую можно вставить в пипетку первого типа до самого ее конца. После этого соедините пипетку второго типа с иглой калибра 19 Ga с помощью зажима EC. Затем поместите изолированный спинной мозг в ванночку.

На протяжении всего процесса заполнения постоянно промывайте его охлажденным CSF. После этого установите пипетку типа 1 в держатель для электрода так, чтобы ее заднее отверстие можно было легко соединить со шприцем с помощью гибкой трубки. В данной процедуре сначала с помощью шприца наберите CSF в пипетку типа 1.

Затем отметьте аксональный тракт или корешок, который необходимо заполнить. После этого извлеките гибкую трубку из заднего отверстия. Затем присоедините пипетку второго типа к другому шприцу.

Вставьте её в пипетку первого типа, в которой под микроскопом удерживается аксональный тракт или нервный корешок. Используя шприц, присоединенный к пипетке второго типа, аспирируйте СМЖ A так, чтобы остаток СМЖ A едва покрывал аксональный тракт. Затем извлеките пипетку второго типа из пипетки первого типа.

В течение нескольких минут контролируйте уровень A CSF, чтобы убедиться в герметичности уплотнения аксонального тракта или нервов. После этого растворите краситель в A CSF или 0,2% Triton X 100 в дважды дистиллированной воде. Заберите раствор в пипетку второго типа, создав слабое отрицательное давление с помощью подключенного шприца, стараясь не допустить попадания пузырьков воздуха.

Затем введите пипетку второго типа, содержащую краситель, в остаточный раствор A CSF. Используя пипетку первого типа, медленно введите краситель в A CSF, осторожно создавая положительное давление с помощью шприца. Следите за тем, чтобы не допустить появления пузырьков воздуха и не вызвать смещение целевой ткани внутри кончика пипетки. Если при введении красителя в пипетку первого типа попал пузырек воздуха, удалите его, поднеся кончик пипетки второго типа вплотную к пузырьку и осторожно создав слабое отрицательное давление с помощью присоединенного шприца.

После высвобождения достаточного количества красителя извлеките пипетку типа два. Затем инкубируйте ткань в темноте от 6 до 20 часов, в зависимости от типа эксперимента. По истечении времени, необходимого для заполнения, осторожно извлеките электрод из ткани.

Затем ткань готова к визуализации или гистологическому исследованию. Здесь представлена схематическая диаграмма, демонстрирующая одновременное введение трех различных конъюгированных с флуоресцентными красителями декстранов в мотонейроны, сенсорные афференты и спинальные интернейроны; мотонейроны и сакральные сенсорные афференты были заполнены методом ретроградного транспорта с использованием Cascade blue Dextran и Texas red dextran через вентральные и дорсальные корешки соответственно. Зеленый флуоресцентный декстран был введен в спинальные интернейроны, аксоны которых поднимаются через вентральный канатик.

Здесь представлено конфокальное изображение среза крестцового отдела спинного мозга, в котором нейроны были помечены методом ретроградного транспорта. Обратите внимание, что помеченные сенсорные афференты расположены преимущественно ипсилатерально. При наличии нескольких контралатеральных проекций, помеченные моторные нейроны находятся ипсилатерально относительно заполненного вентрального корешка, в то время как помеченные интернейроны расположены контралатерально по отношению к нему, что указано наконечником стрелки.

После выполнения данной процедуры можно применить дополнительные методы для получения ответов на ключевые вопросы, касающиеся функциональной связности, возбуждающих и тормозных взаимодействий, типа синапсов, распределения и выработки нейромедиаторов в нейронах поля DI. Этот метод открыл исследователям в области нейрофизиологии спинного мозга и ствола мозга путь к выявлению специфических популяций нейронов с помощью ион-чувствительных красителей. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как вводить флуоресцентные и/или ион-чувствительные красители в нейроны и сенсорные волокна изолированного спинного мозга.