Настройка Aspergillus Нигер Морфология за счет добавления частиц талька Micro

Данный метод позволяет создавать и характеризовать микрочастице-зависимые морфологические структуры нитчатого гриба Aspergillus niger для установления корреляции между морфологией гриба и его продуктивностью. Культивируйте A. niger в трехлитровом биореакторе с перемешиванием в течение 72 часов в присутствии или отсутствии микрочастиц для расчета удельной продуктивности. Отбирайте пробы в определенные моменты времени и определяйте сухой вес биомассы и активность β-фруктозидазы.

Через 72 часа исследуйте морфологию гриба с помощью микроскопии и охарактеризуйте ее путем цифрового анализа изображений. Затем объедините соответствующие параметры анализа изображений в показатель морфологии, который математически коррелирует со специфической продуктивностью. В конечном итоге данный метод позволяет точно формировать и всесторонне характеризовать морфологию Aspergillus niger для более глубокого понимания морфогенеза нитчатых микроорганизмов.

Aspergillus niger на протяжении многих десятилетий является важным промышленным инструментом в биотехнологии. Одной из наиболее интригующих и зачастую неконтролируемых характеристик Aspergillus niger и родственных видов является их сложная морфология, варьирующаяся от плотных сферических пеллетов до вязкого мицелия в зависимости от условий культивирования. Основным преимуществом нашей методики является то, что благодаря добавлению микрочастиц мы теперь можем целенаправленно формировать морфологию гриба в соответствии с конкретными потребностями технологического процесса.

До настоящего времени не было описано ни одного другого метода такой модификации морфологии грибов. Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы, касающиеся культивирования нитчатых микроорганизмов. Это обусловлено тем, что для промышленного применения крайне важно контролировать морфологию грибов, а также различать морфологию с высокой и низкой продуктивностью.

Наш протокол предоставляет средства для необходимой настройки и характеристики морфологии грибов. Хотя данный метод позволяет изучить морфологию Aspergillus niger, он также может быть применен к другим нитчатым микроорганизмам, таким как штаммы Penicillium или Streptomyces. Подготовьте четыре биореактора для стерильного культивирования в соответствии с описанием в сопроводительном протоколе.

Текст основан на добавлении микрочастиц при культивировании Aspergillus niger с различной морфологией. Через 72 часа перенесите 50 мл образцов культуральной среды в пробирку Falcon.

Образцы биомассы следует брать как минимум в двух повторностях; после высушивания в эксикаторе взвесьте целлюлозный фильтр на микровесах. Поместите фильтр в воронку Бюхнера, подключенную к водяному вакуумному насосу, отфильтруйте 10 мл образца, а затем 10 мл деионизированной воды для удаления компонентов среды из биомассы; один раз сложите фильтр пополам.

Поместите образец в стеклянную чашку Петри и в сушильный шкаф до достижения постоянной массы. Перенесите фильтр в эксикатор и дайте ему остыть. Затем измерьте массу.

Рассчитайте сухую массу биомассы на литр путем измерения веса, вычисления разности масс фильтров и последующего деления на объем образца для ферментативных анализов на глюкозооксидазу и пероксидазу. Храните образцы на льду, используя шприц объемом 1,5 мл. Пропустите суспензию культуры через фильтр из ацетата целлюлозы в реакционную пробирку для проведения анализа на бета-фруктозидазу.

Для обеспечения статистической достоверности результатов мы тщательно подготавливаем два образца в трехкратной повторности. Чтобы начать анализ, добавьте 20 µL образца в пробирку; для контроля расщепления сахарозы до глюкозы, зависящего от pH и температуры, используйте 20 µL деионизированной воды вместо 20 µL образца. Кроме того, для каждого образца подготовьте отрицательный контроль для определения остаточной глюкозы в культуральной бульонной среде с помощью данного анализа.

20 µL термоинактивированного образца. Для инициирования реакции превращения сахарозы в глюкозу добавьте 200 µL 1,65 М раствора сахарозы. При pH 5,4 к 20 µL образца инкубируйте все реакционные пробирки в нагревательном блоке при 40 °C в течение 20 минут. Остановите реакцию, нагрев пробирки при 95 °C в течение 10 минут после предварительного охлаждения на льду.

При необходимости центрифугируйте образцы, затем разведите их для проведения анализа таким образом, чтобы измеряемое поглощение находилось в пределах диапазона калибровки. Затем в лунки микротитрационного планшета внесите по 2 µL образца для каждой реакции. Измерения образцов проводите в трех повторностях.

Также подготовьте калибровочную кривую для 10 растворов глюкозы с концентрацией от 1 mM до 15 mM. Для калибровки нулевой точки используйте 2 µL деионизированной воды. Затем добавьте по 200 µL раствора реагента в каждую пробирку.

Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Измерьте оптическую плотность при 450 нм с помощью микропланшетного ридера Sunrise на 96 лунок и программного обеспечения для сбора данных Magellan. Откройте таблицу с результатами в электронном редакторе и постройте калибровочный график стандартной кривой.

Рассчитайте активность для каждого образца. Затем вычислите активность бета-фруктозидазы, вычтя значения соответствующего отрицательного контроля из активности образца. В завершение рассчитайте удельную продуктивность, учитывая сухой вес биомассы и активность бета-фруктозидазы.

Поместите три миллилитра культуральной суспензии в пластиковую чашку Петри и разведите физиологическим раствором хлорида натрия для разделения морфологических структур. Качество микроскопических снимков имеет исключительное значение. Для последующего анализа изображений следует проявлять особую осторожность на этапе разведения.

Поместите чашку Петри под микроскоп, оснащенный встроенной камерой. Получите и сохраните около 100 изображений морфологических структур для каждого образца, следя за тем, чтобы на каждом снимке был полностью запечатлен хотя бы один объект. Продолжайте аналогичным образом с чашками, содержащими образцы из разных реакторов, каждый раз получая новые изображения.

Обратите внимание на различия в морфологии роста образцов из разных реакторов, выращенных с разным количеством добавленного талька. Затем откройте все изображения одного и того же образца в программе для обработки изображений Image J. С помощью инструмента Process переведите изображения в бинарный вид.

Преобразуйте изображения в черно-белый формат, чтобы применить команду ко всей серии снимков. Затем используйте макрокод и откройте один из снимков, содержащий масштабную линейку. Проведите прямую линию вдоль масштабной линейки, чтобы определить количество пикселей, соответствующих 2000 microns.

Выберите инструмент анализа (analyze tool), установите параметры измерения и выберите следующие факторы формы: диаметр Ферре (ferrets), площадь и периметр. Для обработки серии изображений используйте макрокод. Теперь откройте электронную таблицу с результатами значений факторов формы.

Для каждого изображения рассчитайте показатель морфологии, используя все изображения одного образца. Вычислите среднее значение этого показателя. С помощью программы для построения графиков и анализа данных постройте зависимость показателя морфологии от удельной продуктивности.

Определите математическую зависимость с помощью математической регрессии путем добавления возрастающих концентраций микрочастиц талька. Восемь Niger SKAN 10 15. Морфология изменяется от истинной морфологии пеллетов до дисперсной или даже мицеллярной, тогда как при стандартных условиях наблюдается ожидаемая морфология пеллетов.

Примечательно, что мицелиальная морфология формируется при добавлении в среду микрочастиц талька в концентрации 10 г/л. Одновременно с этим активность бетофруктозы увеличивается примерно в три раза; при этом добавлении одного или трех г/л порошка талька наблюдается дисперсная морфология с двукратным увеличением фруктозной активности согласно параметрам, определенным с помощью автоматического анализа изображений. Морфология, зависящая от микрочастиц, может быть всесторонне описана с помощью анализа морфологии.

Следует отметить, что идеально круглые гладкие гранулы на микроскопических изображениях будут выглядеть как идеальные круги. При стандартных условиях число морфологии стремится к единице. Для материала в реакторе один число морфологии составляет около 0,8.

Морфология в четвертом реакторе при концентрации 10 г/л. Тальк в виде порошка характеризуется числом морфологии около 0,1. Число морфологии для второго и третьего реакторов с концентрациями талька 1 и 3 г/л находится между этими крайними значениями, что свидетельствует о дисперсной морфологии.

Поскольку морфология, зависящая от микрочастиц, тесно связана с продуктивностью бета-фруктозоцитов, после разработки данной методики была установлена четкая математическая корреляция между морфологией, количеством и продуктивностью. Этот метод открыл исследователям в области биотехнологии путь к дальнейшему изучению морфологии грибов и, в особенности, ее связи с продуктивностью. Следуя данной процедуре детального создания специфических морфологических перекрестных типов грибов, можно исследовать и другие важные аспекты культивирования нитчатых микроорганизмов.

Известно, например, что мицелиальная морфология характеризуется гораздо более высокой вязкостью, чем морфология пеллет. Следовательно, общая продуктивность процесса снижается из-за проблем с очисткой целевого продукта. Наш показатель морфологии поможет в создании моделей культивирования и протоколов, а также расширит наше понимание морфологии грибов в целом.