Выделение и характеристика дендритных клеток и макрофагов из кишечника мыши

Общая цель данной процедуры заключается в быстром выделении дендритных клеток (DCs) и макрофагов кишечника мыши для их фенотипической и функциональной характеристики. Это достигается путем первоначального сбора тканей кишечника. На втором этапе выполняется отделение эпителия кишечника от собственной пластинки слизистой оболочки (lamina propria).

Затем на заключительных этапах процедуры проводится переваривание собственной пластинки слизистой оболочки кишечника. Клетки собственной пластинки окрашивают с помощью конъюгированных флуоресцентных антител и проводят гейтирование для выделения специфических популяций клеток. В конечном итоге это позволяет более точно охарактеризовать и очистить популяции дендритных клеток и макрофагов кишечника для функциональных исследований по оценке продукции цитокинов, презентации антигенов и регуляции иммунных клеток.

Таким образом, основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами является то, что высокая скорость переваривания тканей обеспечивает оптимальную экспрессию поверхностных антигенов клеток, жизнеспособность клеток и их целостность. После усыпления мыши и подтверждения смерти с помощью рефлекса на щипок за палец распылите 70% ethanol на живот и грудную клетку животного. Затем с помощью ножниц сделайте небольшой горизонтальный разрез посередине живота и отгибайте кожу, чтобы обнажить брюшину.

Вскройте брюшину с помощью ножниц, предварившее этому разрезав пилорический сфинктер, чтобы отделить желудок от верхнего отдела тонкого кишечника, и используя пинцет для осторожного отделения брыжейки. Сделайте повторный разрез в области илеоцекального клапана, чтобы полностью освободить тонкий кишечник от толстого кишечника. Продолжайте отделять брыжейку от толстого кишечника и сделайте разрез в области анального отверстия.

С помощью ножниц разрежьте ободочную кишку вдоль и используйте раствор C-M-F-P-B-S комнатной температуры, чтобы вымыть каловые массы и слизь из просвета кишечника. Затем с помощью ножниц и пинцета макроскопически выделите пейеровы бляшки вдоль антимезальной поверхности тонкого кишечника и разрежьте тонкий кишечник продольно.

Затем очистите просвет тонкого кишечника от фекального содержимого и слизи, используя дополнительный объем C-M-F-P-B-S комнатной температуры. Отдельно разрежьте тонкий и толстый кишечник на фрагменты длиной примерно 1.5 сантиметра и поместите их в индивидуальные конические пробирки объемом 50 миллилитров, содержащие 30 миллилитров предварительно подогретого C-M-F-H-B-S-S с FBS и 2 миллимоляр EDTA. Поместите каждую коническую пробирку объемом 50 миллилитров горизонтально в орбитальный шейкер и перемешивайте при 250 RPM в течение 20 минут при 37 °C.

Затем поместите сетчатый фильтр над приемным ведром. Пролейте содержимое каждой конической пробирки объемом 50 мл через сетку, чтобы собрать фрагменты кишечника, после чего поместите их в новые индивидуальные конические пробирки объемом 50 мл, содержащие 30 мл предварительно нагретого C-M-F-H-B-S-S с FBS и двумя миллимолярными EDTA. В завершение верните пробирки в орбитальный шейкер еще на 20 минут.

После второго раунда встряхивания перелейте содержимое каждой пробирки через ситечко. Снова удалите излишки среды с помощью бумажного полотенца, затем перенесите фрагменты кишечника в небольшой пластиковый лодочный контейнер. Самым сложным аспектом этой методики является переваривание ткани; для обеспечения успеха необходимо учитывать все параметры: продолжительность переваривания, свойства коллагеназы, целостность ткани и размер перевариваемого фрагмента ткани, быстро измельченного ножницами.

Измельчите фрагменты кишечника, затем поместите измельченный кишечник в 50-миллилитровый конический тубус, содержащий 20 мл раствора коллагеназы. Поместите конический тубус горизонтально в орбитальный шейкер и переваривайте фрагменты кишечника при 200 об/мин в течение 10–20 минут при 37 °C. Затем коротко перемешайте содержимое тубуса на вортексе, чтобы обеспечить полную диссоциацию любой оставшейся ткани кишечника, и профильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр с размером пор 100 мкм непосредственно в 50-миллилитровый конический тубус.

Наконец, долейте в коническую пробирку среду C-M-F-H-B-S-S с FBS и дважды центрифугируйте клеточную суспензию в течение пяти минут при 425 ×g при температуре четырех градусов Celsius. Затем слейте супернатант, ресуспендируйте клеточный осадок в ледяной среде C-M-F-H-B-S-S с FBS и поместите образцы на лед. После этого проведите окрашивание клеток на интересующие поверхностные белки.

Начните с построения точечного графика, исключив клетки, положительные по окраске на мертвые клетки, как показано здесь. Затем исключите события-дублеты, как показано здесь и здесь. Теперь используйте каналы прямого и бокового светорассеяния для выделения интересующих клеток, стараясь исключить клеточный дебрис.

Затем создайте еще один точечный график, используя гейтирование по CD 45-положительным и IAB-положительным антигенпрезентирующим клеткам. На отдельном точечном графике определите области для разграничения специфических субпопуляций дендритных клеток и макрофагов. Область R1, показанная здесь, охватывает CD 11 C-положительные и CD 11 B-слабоотрицательные клетки.

Область R two охватывает клетки, имеющие такой же уровень поверхностной экспрессии CD 11 C, как и клетки в области R one, но также экспрессирующие CD 11 B. Области R three определяют клетки, которые являются CD 11, B-положительными и CD 11 C-слабоотрицательными. Эти три области могут быть далее проанализированы на экспрессию F four 80 и CD 1 0 3 для дифференциации популяций макрофагов и DC соответственно. Как видно на этой диаграмме рассеяния, CD 11 C-положительные CD 11 B-слабоотрицательные клетки в области R one будут экспрессировать высокие уровни alpha ein CD 1 0 3 и низкие уровни F four 80.

На этом точечном графике видно, что CD 11 B-положительные и CD 11 C-положительные клетки в области R2 будут состоять как из DCS, так и из макрофагов, исходя из дихотомической экспрессии CD 1 0 3 и F four 80. Наконец, основываясь на фенотипическом профиле F four 80-положительных и CD 1 0 3-отрицательных клеток, в области R3 гейтированные CD 11 B-положительные и CD 11 C-дефицитные (negative) клетки будут представлять собой макрофаги. Взаимосвязь между продолжительностью переваривания ткани, общим выходом клеток и экспрессией CD 11 B и CD 11 C проиллюстрирована на следующих шести рисунках. Ткань кишечника, которую переваривали в течение 3 минут, дает низкое общее количество клеток, в результате чего для характеристики доступно мало DCS и макрофагов; переваривание ткани в течение 11 минут обеспечивает высокий выход живых клеток, позволяя получить популяции DCS и макрофагов, которые экспрессируют высокие уровни CD 11 B и CD 11 C и являются фенотипически различными.

Напротив, переваривание в течение 50 минут приводит к выходу клеток, сопоставимому с оптимизированным перевариванием. Однако дифференцировка различных популяций клеток с использованием CD 11 B и CD 11 C становится более затруднительной, так как экспрессия CD 11 C снижается, а количество погибших клеток увеличивается.

Таким образом, при оптимизации параметров переваривания тканей кишечника можно быстро добиться высокого выхода клеток. В результате экспресс-изоляция дендритных клеток и макрофагов кишечника мыши может быть полезна для оценки функциональных свойств иммунных клеток с сохранными поверхностными антигенами.