Удобный и общее выражение платформы для производства секретируемых белков из клеток человека
31 июля 2012 г.
В пост-человеческой эры геномики, наличие рекомбинантных белков в родной конформации имеет решающее значение для структурных, функциональных и терапевтических исследований и разработок. Здесь мы описываем испытаний и масштабные экспрессии белков системы человеческих эмбриональных почек 293T клетки, которые могут быть использованы для производства различных рекомбинантных белков.
В данном видео мы описываем экономичный по времени и затратам метод экспрессии секретируемых белков в клетках HEK 293T. Сначала в шестилуночном планшете подготавливают культуру клеток HEK 293T с конфлюэнтностью 40%. Затем готовят смесь для трансфекции, разводя GeneJuice и тестовые плазмиды в безсывороточной среде.
Смесь для трансфекции наносят на клетки, которые затем инкубируют при 37 °C для экспрессии белка. Определение белка в супернатанте можно провести с помощью вестерн-блоттинга. После подбора подходящего конструкта процедуру можно масштабировать с использованием 10-слойных клеточных фабрик.
Трансфекцию клеток проводят с использованием PEI в качестве реагента для трансфекции. Белок можно выделить из супернатантов культур с помощью тангенциальной поточной фильтрации с последующей аффинной хроматографией. В конечном итоге данная платформа позволяет экспрессировать широкий спектр макромолекул в миллиграммовых количествах.
Основное преимущество данной методики перед существующими способами, такими как экспрессия в клетках насекомых на основе бакуловирусов, заключается в том, что большое количество конструктов может быть отобрано и масштабировано для экспрессии с получением результатов в течение трех недель. Эту процедуру продемонстрируют Хелло Эйден, Шада Зини и Джонатан Кук, три аспиранта моей лаборатории. Начните с посева 250 000 клеток HEK 293T на лунку в объеме 1 мл в 6-луночный планшет; добавьте по 1 мл на лунку среды DMEM, дополненной 10% FBS и пенициллином-стрептомицином, и осторожно перемешайте планшет для равномерного распределения клеток.
Затем инкубируйте клетки в течение ночи в увлажненном инкубаторе с 5% carbon dioxide при 37 °C. Когда клетки достигнут конфлюэнтности около 40%, замените SUP natum двумя миллилитрами свежей среды для приготовления смеси для трансфекции. Сначала отберите аликвоту 90 µL безсывороточного DMEM в эппендорф-пробирку.
Затем добавьте 3 µL реагента для трансфекции Gene Juice, осторожно перемешайте содержимое пробирки и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут. Далее добавьте 10 µL стокового раствора очищенной плазмидной ДНК, полученной методом мини-препа, в концентрации 100 ng/µL, предназначенной для трансфекции.
Перемешайте содержимое пробирки и оставьте при комнатной температуре на 15 минут. Для проведения трансфекции нанесите смесь на клетки HEC 2 9 3 T. Покапельно, осторожно покачивая планшет, равномерно распределите трансфекционную смесь.
Затем инкубируйте клетки при 37 °C. Через 24 часа добавьте по 1 мл свежей среды в каждую лунку и инкубируйте еще 48 часов. Через три дня после трансфекции соберите супернатант и определите уровни экспрессии исследуемого белка с помощью вестерн-блоттинга.
После идентификации подходящего конструкта процедуру трансфекции можно масштабировать. Используя 10-слойные клеточные фабрики, заполните фабрику 1,2 литрами DMEM, дополненного 5% FBS. Затем добавьте 200 миллионов клеток HEC 2 9 3 T, равномерно распределив их по всем слоям.
Четыре флакона для культивирования клеток T 225 см², выращенные до 100% конфлюэнтности, содержат около 200 миллионов клеток. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение ночи. Приготовьте смесь для трансфекции во флаконе T 75, разведя 840 µg ДНК в 84 мл стерильного 1× PBS.
Добавьте 2,5 milliliters раствора полиэтиленимина (PEI) в концентрации 1 mg/mL и инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 15 минут. Раствор должен стать мутным. Затем медленно перелейте трансфекционную смесь в cell factory и тщательно распределите ее по поверхности.
Общие слои. Добавьте вальпроевую кислоту до конечной концентрации 4 mM. Это позволит увеличить выход экспрессии после добавления смеси для трансфекции.
Инкубируйте культуру при 37 °C в течение четырех дней для экспрессии белка. Соберите среду через четыре дня после трансфекции, после чего немедленно очистите клеточный завод для повторного использования; центрифугируйте собранную среду при 6 000 G в течение 30 минут при 4 °C и профильтруйте ее через стерильный чашечный вакуумный фильтр с порами 0,22 мкм для удаления твердых частиц. Затем используйте систему тангенциальной поточной фильтрации CentraMate для концентрирования супернатанта до 75 мл.
После концентрирования супернатанта целевой белок можно очистить с помощью аффинной хроматографии. В данном эксперименте мы очистили субъединицы с HA-тегом внеклеточного домена рецепторов AAL человека с использованием описанной здесь крупномасштабной системы с последующей высокоаффинной анти-HA хроматографией. Результаты представлены на данном анализе SDS-PAGE с окрашиванием кумази.
Внеклеточные домены альфа- и гамма-субъединиц рецептора интерлейкина-2 мигрируют с молекулярными массами 40 килродальтон и 46 килродальтон. Гетерогенность гликанов EnLink, присутствующих на IL-2 R альфа и IL-2 R гамма, привела к размытию полос на SDS-PAGE геле. Полоса с более высокой молекулярной массой соответствует загрязняющему BSA.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как экспрессировать белки из культур клеток человека с использованием 10-слойных клеточных фабрик. Не забывайте, что клетки HC 2 93 T считаются биоопасными, и работа с ними должна проводиться с соблюдением второго уровня биологической безопасности. Всегда используйте соответствующие средства индивидуальной защиты; поверхности должны дезинфицироваться в соответствии с институциональными и государственными правилами.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена экономичная по времени и затратам процедура экспрессии секретируемых белков с использованием клеток эмбриональных почек человека 293T. Этот метод позволяет получать рекомбинантные белки в нативной конформации, что имеет решающее значение для различных исследовательских задач.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Экспрессия белков
- Рекомбинантные белки
- Методы культивирования клеток
Теоретические основы
- Рекомбинантные белки имеют решающее значение для структурных и функциональных исследований.
- Клетки эмбриональной почки человека 293T широко используются для производства белков.
- Эффективные методы экспрессии белков могут способствовать развитию исследований и терапевтических средств.
- Вестерн-блоттинг является распространенным методом детекции белков.
Цель исследования
- Описать масштабируемую систему экспрессии белков.
- Представить детальный протокол получения секретируемых белков.
- Облегчить подбор подходящих конструктов для дальнейших исследований.
Используемые методы
- Подготовка культуры клеток 293T с конфлюэнтностью 40% в шестилуночном планшете.
- Приготовление смеси для трансфекции с использованием бессывороточной среды.
- Инкубация клеток при 37 °C для экспрессии белков.
- Детекция белков в супернатанте методом вестерн-блоттинга.
Основные результаты
- Успешная экспрессия секретируемых белков в клетках 293T.
- Идентификация подходящих конструктов для производства белков.
- Масштабируемость процедуры с использованием 10-слойных клеточных фабрик.
- Демонстрация экономически эффективного подхода к производству рекомбинантных белков.
Выводы
- Описанный метод эффективен для получения рекомбинантных белков.
- Данный подход может быть масштабирован для удовлетворения более крупных потребностей производства.
- Вестерн-блоттинг эффективен для подтверждения экспрессии белка.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Эффективное производство секретируемых белков человека в нативной конформации является критически важным этапом для биофармацевтических разработок и доклинических исследований. Данная платформа на основе клеток HEK 293T позволяет быстро, масштабируемо и экономически выгодно получать миллиграммовые количества функциональных белков, что обеспечивает возможность проведения структурных, биофизических и биохимических исследований. Этот подход напрямую решает проблему необходимости посттрансляционных модификаций, характерных для млекопитающих, и ускоряет скрининг конструктов и масштабирование производства для различных терапевтических мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает возможность экспресс-скрининга нескольких конструктов для выявления оптимальных кандидатов для экспрессии белков.
- Поддерживает функциональную валидацию секретируемых белков с нативными посттрансляционными модификациями.
- Облегчает исследование сигнальных путей и снижение механистических рисков для человеческих и вирусных мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированное, масштабируемое производство белков для последующей разработки анализов.
- Обеспечивает воспроизводимый количественный выход белков, подходящий для стандартизации между различными платформами.
- Обеспечивает надежное снабжение белками для скрининга соединений и исследований связывания.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает производство белков, имеющих значение для патологического процесса, включая цитокины и вирусные гликопротеины, для трансляционных исследований.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации за счет контроля качества и функциональности белков.
- Снижает риск возникновения артефактов гликозилирования, нехарактерных для человека, в доклинических моделях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Эта платформа объединяет этапы от первичного скрининга конструктов до крупномасштабного производства белков, связывая фундаментальные биологические исследования и доклинические разработки.
- Биология открытий: Ускоряет проверку гипотез и отбор конструктов за счет обеспечения параллельной экспрессии и детекции с помощью вестерн-блоттинга.
- Скрининг: Обеспечивает получение белков, готовых к анализу, с масштабируемым выходом и стабильным качеством.
- Аналитика: Предоставляет количественные данные для сравнения эффективности конструктов и оптимизации очистки.
- Трансляционные исследования: Согласует производство белков с системами, имеющими значение для изучения заболеваний, и исследованиями биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает универсальный рабочий процесс, адаптируемый к различным классам белков и исследовательским задачам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней и снижает неопределенность в понимании механизмов действия.
- Операционная ценность: оптимизирует производство белков, требуя минимального количества специализированного оборудования и обеспечивая короткие сроки выполнения.
- Стратегическая ценность: позволяет быстрее принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала на ранних этапах НИОКР.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации проектов с учетом рисков за счет обеспечения высококачественными реагентами для нескольких программ.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток млекопитающих и методами очистки белков.
- Необходим доступ к стандартным CO2-инкубаторам и системам тангенциальной фильтрации для масштабирования процесса.
- Требуется межкомандная стандартизация дизайна конструктов и методов детекции.
- Метод может быть адаптирован для коэкспрессии, сборки сложных белковых комплексов и производства вирусных векторов.
- Для работы с клетками HEK 293T необходимо соблюдение мер предосторожности при обращении с биологически опасными материалами и требований уровня биобезопасности 2.
