Эффективное производство и очистка рекомбинантного мышиного Kindlin-3 от клетках насекомых биофизической исследований

Общая цель следующих экспериментов заключается в эффективном производстве миллиграммовых количеств Miran Kinlin 3 и культуры клеток насекомых, которые не могут быть получены в других экспрессирующих хозяевах. Это достигается путем пересечения COT, переносного вектора KINLIN three вместе с сконструированным вирусом bao обратно в середину для создания рекомбинантного вируса bao, несущего ген KINLIN three. На втором этапе вирус амплифицируется внутри клеток насекомых для производства достаточного количества вирионов для будущих этапов.

Затем клетки насекомых заражаются для производства большого количества белка Кинлин-3, чтобы обеспечить нам очистку с помощью быстрой жидкостной хроматографии. Получены результаты, которые показывают, что функциональная кинлин-тройка высокой чистоты может быть получена в миллиграммовых количествах на основе анализа страниц SDS и эксклюзионной хроматографии. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как разжигание трех экспрессий у бактерий, заключается в том, что экспрессия клеток насекомых, инфицированных вирусом желтого пятна, увеличивает выход рекомбинантного белка в десять раз.

SF девять клеток для этой процедуры культивируют и поддерживают в суспензии с использованием среды SF 902 с добавлением 100 мкг на миллилитр пенициллина и 100 мкг на миллилитр стрептомицина. Для генерации вируса бао клетки должны быть культивированы в диапазоне плотности от пяти до 10 до 5 до 10 до шести клеток на миллилитр. Для подготовки девяти клеток SF к трансфекции увидеть примерно один умножить на 10 до шести клеток на лунку стерильного шестилуночного тканевого культурального планшета в двух миллилитрах среды SF 902 с добавлением пенициллина и стрептомицина оставить девять клеток SF примерно на 20 минут при комнатной температуре в вытяжном шкафу для прилипания к основанию пластиковых лунок и таким образом сформировать монослойный рекомбинантный баловирус. путем поперечного сечения плазмиды, ДНК и ДНК BMid на монослойную культуру SF девяти.

Вектор экспрессии папинового нейрона фирмы T three имеет у мыши KINLIN три ген фирмы T three. Под контролем P 10 вирусный промотор BAO обладает фланкирующими вирусными последовательностями bao, позволяющими рекомбинацию с задней серединой, и кодирует С-концевую шипучую шестую метку для последующей очистки, при каждой трансфекции производит от одного до двух микрограммов очищенного MFI T, три с 0,5 микрограммами очищенной средней точки B и 100 микролитрами SF 902 SFM без антибиотиков. Это раствор А в отдельной пробирке, разведите шесть микролитров клеточного эффекта в двух реагентах со 100 микролитрами SF 902 SFM без антибиотиков.

Для каждой реакции трансфекции здесь может быть создана мастер-смесь для уменьшения объема работы с жидкостью, если требуется несколько трансфекций. Это раствор В. Смешайте два раствора А и В, используя приблизительно по 200 микролитров каждого за трансфекцию и инкубируйте комнатной температуры в течение 20 минут для образования комплексов липидной ДНК через 20 минут, разбавьте комплексы липидной ДНК до 800 микролитров на одну трансфекцию SF 902 SFM без антибиотиков. Затем осторожно отсасывайте низкоклеточный монослойный фильтрующий материал SF с девятью клетками и тщательно пипетируйте раствор AB и смесь сред поверх монослоя SF девять.

Инкубируйте трансфицированные клетки во влажном инкубаторе при температуре 27 градусов Цельсия в течение ночи, чтобы создать увлажненную среду для предотвращения высыхания клеток. Поместите миску с шестью лунками в пластиковый контейнер с подсветкой рядом с влажным бумажным полотенцем. На следующий день добавьте еще один миллилитр SF 900 в SFM без антибиотиков К каждой монослойной культуре инкубируйте клетки при температуре 27 градусов Цельсия еще пять дней.

Через пять дней соберите рекомбинантный вирус бао непосредственно из питательной среды и перенесите его в чистую центрифужную пробирку. Очистите все остатки SF девяти клеток центрифугированием при 1000 G в течение пяти минут. При переносе вируса при комнатной температуре, который в полученных суперименах обозначается как P one в чистую пробирку P одного поколения вируса, можно предположить, что ожидаемый титр вируса составляет от 10 до 7 PFU на миллилитр.

Несмотря на то, что бляшка SA может быть выполнена, при необходимости храните вирусный запас P one при температуре при четырех градусах Цельсия в темноте до тех пор, пока не будут использованы девять клеток SF, используемые для амплификации рекомбинантного вируса бало в суспензии, должны иметь плотность от 1,4 умножить на 10 до шести клеток на миллилитр, а культура должна занимать одну 20-ю от общего объема колбы. Например, 50 миллилитров в двухлитровую колбу. Как правило, для оптимальной амплификации ваовируса и производства белка девятиклетка SF должна быть однородной по размеру и сферической.

Инфицируйте культуру клеток SF nine вирусным запасом P one при кратности инфекции или MOI 0,1, используя следующую формулу. Инкубируйте культуру зараженного насекомого P one при температуре 27 градусов Цельсия с встряхиванием при 100 об/мин в течение 72 часов. Через три дня соберите вирус, отделив клетки от среды центрифугированием при 1000 G в течение пяти минут.

При переносе при комнатной температуре осветленный вирус обогащает среду до чистой пробирки. Этот вирусный запас обозначается как P два, а ожидаемый титр вируса составляет от двух до 10 до 8 PFU на миллилитр. Храните этот вирусный материал при температуре четыре градуса Цельсия в темноте до использования, сохраняйте полученные клеточные гранулы при температуре минус 20 градусов Цельсия для последующего подтверждения производства рекомбинантного вируса.

Чтобы начать эту процедуру, выращивают в достаточном объеме SF девять клеточных культур в суспензии и SF 902 s fm. Дополняют 100 мкг на миллилитр пенициллина и 100 мкг на миллилитр стрептомицина. Отношение общего объема культуры к объему колбы должно быть один к пяти.

Инкубируйте суспензионные культуры при температуре 27 градусов Цельсия с встряхиванием при 100 об/мин до тех пор, пока они не достигнут плотности клеток от двух до 10 до шести клеток на миллилитр. Когда SF девять культур имеют плотность от двух до 10 к шести клеткам на миллилитр, они готовы к заражению вирусом бало. Дополните культуры конечной концентрацией 1%-ной фетальной бычьей сыворотки, за которой следует вирусный запас P two.

Чтобы получить MOI одного, инкубируйте инфицированные культуры при температуре 27 ° Цельсия с встряхиванием при 100 об/мин через 72 часа после заражения, собирайте рекомбинантный полигистамин, меченный lin three и экспрессирующий SF девять клеток, центрифугированием при 1000 GS в течение 20 минут при комнатной температуре. Храните полученную клеточную гранулу при температуре минус 20 градусов Цельсия до использования или при температуре минус 80 градусов Цельсия для длительного хранения. Эта процедура начинается с размораживания на льду.

Замороженные гранулы вируса вао инфицировали SF 9, экспрессирующий рекомбинантный кинлин три, и Resus, суспендируя гранулы с буфером для лизиса. После инкубации ресуспендированных клеток с буфером для лизиса в течение 5-10 минут проводят вихревое производство до получения однородной ресусцирационной суспензии для дальнейшего разрушения клеток. Обработайте образец ультразвуком на ледяной бане.

Осветите лизат центрифугированием при 48 000 GS в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. Загрузите полученные суперимена в колонку ловушки объемом пять миллилитров, предварительно уравновешенную буфером для лизиса при четырех градусах Цельсия со скоростью один миллилитр в минуту. Последующие этапы элюирования белка, буферного обмена и концентрации белка не будут демонстрироваться здесь, но подробно описаны в сопроводительной рукописи.

После того, как раствор буферного обменного белка получен, нанесите его на предварительно уравновешенную колонку с высоким содержанием гепарина объемом пять миллилитров с высокой точностью ловушки, используя ACTA FPLC со скоростью 0,5 миллилитров в минуту. Связанный KINLIN 3 ссылается с помощью линейного градиента хлорида натрия в том же буфере, увеличивающегося со скоростью 10 миллимоляров на миллилитр рекомбинантов гистаминовых меток. Ожидается, что KINLIN 3 будет элюироваться при уровне около 0,6 молярного хлорида натрия после концентрации белка, заключительным этапом является буферный обмен белка с помощью хроматографии исключения размера, нанесение очищенного белка на колонку SUEx S 210 30, очистка белков в соответствии с размером путем нанесения буфера на колонку со скоростью 0,5 миллилитров в минуту.

Белок, выделяемый из колонки, фракционируется и контролируется с помощью абсорбента с температурой 280 нанометров. Успешность генерации рекомбинантного вируса была подтверждена путем оценки наличия рекомбинантного Kinlin 3 и девяти клеток COT, ТРАНСФИЦИРОВАННОГО SF, с помощью SDS и западного анализа, как видно в этой репрезентативной западной крови шести небольших SF девяти культур с использованием антитела против шипения SF девять клеток в крупномасштабных экспериментах. Рекомбинантный KINLIN 3 был частично очищен с помощью иммобилизованной аффинной хроматографии металлов.

Основное изображение геля на этом рисунке показывает SDS страницу сродства никеля очищенного рекомбинантного мышиного кинлина три, экспрессированного в инфицированном вирусом BAO SF девяти клетках, поглощенный белок был упомянут с использованием оле градиента, показанного над изображением геля. MW указывает на маркер молекулярной массы LYS - это лизат всей клетки, FT - это поток через WI - это промывка один, а WII - это промывка два. Также был проведен вестерн-блоттинг с использованием фракций элюирования для подтверждения присутствия спроектированной метки HIS на рекомбинантном белке.

Затем частично очищенный KINLIN 3 был дополнительно очищен до почти однородности с помощью ионообменной хроматографии с использованием гепариновой колонки. На этой панели синим цветом показан элуцианский профиль, наблюдаемый на глубине 280 нанометров, с одним симметричным пиком, ускользающим от линейного градиента хлорида натрия, обозначенного зеленым цветом, с использованием диапазона концентраций хлорида натрия от 0,05 моляра до 1,0 моляра. На нижней панели представлены результаты страничного анализа SDS фракционированного элюирования, демонстрирующие наличие 75 килодальтонного белка Kinlin three.

В качестве заключительного шага KINLIN Three Purity была отполирована с помощью эксклюзионной хроматографии для удаления заполнителей и достижения однородности. Этот репрезентативный профиль элуцианской фильтрации геля изготовлен из очищенных трех Kinlin с использованием SUEx S 200 в Tris HCL pH 7,5 150 миллимолярного хлорида натрия и одного миллимолярного DTT при 20 градусах Цельсия. Основываясь на объеме элюирования, KINLIN 3 мигрирует, как и ожидалось, для белка размером 75 килодальтон, что позволяет предположить, что он преимущественно мономерный.

На следующем рисунке показаны результаты работы на странице SDS высококонцентрированного очищенного рекомбинантного кинлина 3 с мечкой K three в концентрации 14,5 миллиграммов на миллилитр. Производство миллиграммовых количеств высокой чистоты полноразмерного кинлин-3 и культуры клеток насекомых позволит провести обширные структурные исследования и биохимический анализ белка. В этом исследовании также был проведен термосдвиговый анализ на основе термопола, чтобы определить, какие буферы стабилизируют KINLIN 3.

KINLIN 3 разбавляли в различные буферы, содержащие двумерный экран зависимости pH от концентрации хлорида натрия. Верхняя панель представляет собой 3D-гистограмму температур перехода, а нижняя панель показывает изменение температуры перехода от рассчитанного среднего значения в 50,4 градуса Цельсия. Батончики окрашиваются в соответствии с диапазоном температур, которому они соответствуют.

Было отмечено, что KINLIN 3 стабилен при высоких концентрациях хлорида натрия в диапазоне PA от 7,0 до 9,0 при постоянной температуре перехода 55 градусов Цельсия. Также было замечено, что температура перехода Кинлин-3 составляла примерно 55 градусов Цельсия в диапазоне PA от 7,0 до 7,5. Независимо от концентрации хлорида натрия.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как производить высокочистую функциональную рекомбинантную растопку. Три для углубленной биофизической характеристики и дальнейших исследований. Аналогичные подходы можно использовать и с другими сложными в приготовлении образцами белка, и мы рекомендуем его применение в таких случаях.