Одноместный мутагенеза бисульфит ооцитов

Общая цель данной процедуры заключается в анализе метилирования ДНК в одном ооците. Сначала из собранных ооцитов удаляют кумулюсные клетки и мыльный палиты. На втором этапе ооцит помещают в раствор для лизиса AROS в соотношении два к одному, чтобы предотвратить потерю или деградацию крайне малого количества ДНК.

Затем проводится бисульфитный мутагенез с последующей амплификацией с помощью вложенной полимеразной цепной реакции. Заключительным этапом является лигирование и клонирование ПЦР-продукта. Затем клоны отбирают, амплифицируют методом ПЦР и отправляют на секвенирование.

В конечном итоге, бисульфитный мутагенез и секвенирование используются для выявления метилирования ДНК в цитозин-фосфат-гуаниновых (CpG) динуклеотидах интересующего региона в отдельном ооците. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как бисульфитный мутагенез больших популяций клеток, является возможность получения данных из одного ооцита без объединения клеток, что исключает ПЦР-ошибки и контаминацию соматическими клетками. В день сбора ооцитов свежеприготовьте растворы, указанные в письменном протоколе; при приготовлении растворов снижайте риск контаминации ДНК, часто меняя перчатки и используя наконечники с фильтрами, а также держите открытые пробирки под наклоном от себя и закрывайте их крышками, когда они не используются.

Начните сбор OSI, поместив препарированные яйцеводы мыши в среду M2 и осторожно потянув за M-шпуль, чтобы извлечь комплекс кумулюсных клеток. Затем отделите ооциты от комплекса кумулюсных клеток, используя раствор гиалуронидазы с концентрацией 0,3 mg/mL в капле среды M2 объемом 30 µL. Держите ооциты в растворе только в течение времени, необходимого для удаления кумулюсных клеток, так как длительное воздействие может их повредить.

Промойте ооциты в каплях среды M two объемом 30 µL, перенося их из одной капли в другую. Периодически удаляйте клетки кумулюса; всего необходимо провести три промывки. Удалите Z из LUCITA с помощью кислого раствора тирозина.

Сначала поместите ооциты в одну каплю раствора объемом 30 µL, затем перенесите их в другую каплю объемом 30 µL. Это необходимо, так как любая переносимая с клетками среда разбавит кислоту и снизит её эффективность. Держите ооциты в растворе только в течение времени, необходимого для удаления zona pellucida, так как длительное воздействие может повредить их.

После удаления блестящей оболочки снова промойте ооциты в капле среды M2 объемом 30 µL. Для выполнения включения в agarose (агарозу) сначала поместите раствор для лизиса на нагревательный блок с температурой 70 °C. Добавьте предварительно нагретую низкоплавкую агарозу (LMP agarose) к раствору для лизиса в соотношении 2:1 (агароза к раствору для лизиса). Затем поместите один ооцит на чистый предметное стекло в минимальном объеме среды M2.

Следующим шагом является помещение одиночной клетки в раствор Agros и лизирующий раствор. Это необходимо сделать быстро, так как Agros затвердевает при температуре ниже 65 °C. С помощью пипетки под микроскопом наберите 10 µL лизирующего раствора Agros.

Осторожно нанесите около 1 µL или меньше раствора для лизиса agros на предметное стекло, чтобы он смешался с минимальной средой. Аккуратно захватите ооцит кончиком пипетки. Затем перенесите все 10 µL в пробирку einor с 300 µL минерального масла, чтобы получившаяся капля приняла сферическую форму.

Инкубируйте пробирку на льду в течение 10 минут для проведения лизиса. Удалите 300 µL минерального масла и добавьте 500 µL буфера для лизиса SDS. Инкубируйте образец в водяной бане при температуре 50 °C в течение ночи на второй день.

Приготовьте свежие растворы для бисульфитного мутагенеза согласно письменному протоколу. Начните мутагенез с полного удаления 500 µL буфера для лизиса SDS. Имейте в виду, что любой остаток буфера для лизиса разбавит агар при нагревании, и бусина будет более подвержена растворению на последующих этапах.

После полного удаления лизирующего буфера добавьте 300 µL минерального масла. Инкубируйте образец в течение двух с половиной минут на термоблоке при температуре 90 °C. Будьте осторожны, чтобы не перемешивать, не встряхивать образец и не допускать колебаний температуры.

Через две с половиной минуты выдержите образец на льду в течение 10 минут. Для проведения денатурации удалите минеральное масло и добавьте в пробирку 1 мл 0,1 M гидроксида натрия, после чего слегка постучите по пробирке и переверните ее пять-шесть раз.

Инкубируйте образец в течение 15 минут. В водяной бане при температуре 37 °C, переворачивая пробирку каждые три-четыре минуты, добейтесь того, чтобы гранула всплыла в гидроксиде натрия. Убедитесь, что гранула больше не находится на дне пробирки.

Для проведения обработки сульфитом сначала осторожно центрифугируйте пробирку после удаления гидроксида натрия. Добавьте 300 µL минерального масла и 500 µL раствора сульфита BIS. Избегайте воздействия света и инкубируйте пробирку в течение трех с половиной часов на водяной бане при 50 °C.

Теперь проведите десалинацию. Сначала инкубируйте образец на льду в течение трех минут, после чего удалите минеральное масло и раствор сульфита BIS. После осторожного центрифугирования добавьте один миллилитр 0,3 молярного раствора гидроксида натрия, слегка постучите по пробирке и переверните ее пять-шесть раз.

Инкубируйте образец в течение 15 минут в водяной бане при 37 °C, переворачивая пробирку каждые три-четыре минуты; перед началом ПЦР гранулы должны плавать в гидроксиде натрия. Промойте образцы, предварительно осторожно центрифугируя их.

Затем удалите гидроксид натрия и добавьте 1 мл 1x TE (pH 7.5). Перемешивайте в течение 5–10 минут при комнатной температуре. После второго осторожного центрифугирования удалите 1x TE.

Повторите этот процесс промывки дважды. Затем добавьте 1 мл автоклавированной дважды дистиллированной воды. Перемешивайте в течение 5–10 минут при комнатной температуре, осторожно центрифугируйте в третий раз и удалите воду.

Повторите промывку дважды дистиллированной водой двойного перегона. В конце удалите весь супернатант, оставив только арос-бид. Убедитесь, что pH супернатанта составляет 5.0.

Если супернатант все еще слишком щелочной, повторно промойте гранулы дважды дистиллированной водой. Тем временем добавьте смесь для первого раунда ПЦР в ПЦР-пробирку, как описано в письменном протоколе. Сдвиньте solid agro speed к краю пробирки einor.

Затем осторожно перенесите agro speed в ПЦР-пробирку, нагрейте до 70 °C в течение одной минуты, перемешайте и проведите амплификацию согласно письменному протоколу. После первого раунда амплификации подготовьте реакционную смесь для второго раунда ПЦР, используя 5 µL продукта первого раунда в качестве матрицы. Убедитесь, что пипетирование происходит ниже слоя минерального масла.

Переходите ко второму раунду амплификации в качестве диагностического теста, как указано в тексте. Образцы после второго раунда можно обработать рестрикционным ферментом, специфичным для определенного штамма или паттерна метилирования, и провести электрофорез продуктов расщепления на 8% акриламидном геле. Любые полученные гетерогенные полосы указывают на наличие более чем одной последовательности. Для клонирования продукта второго раунда лигируйте его в вектор и выполните TA-клонирование, как описано в рукописи к данному видео. После TA-клонирования высейте всю реакционную смесь на чашку с агаром LB, дополненным ампициллином, X-gal и IPTG, и инкубируйте чашку при 37 °C в течение ночи.

Затем добавьте в ПЦР-пробирку мастер-смесь для ПЦР-скрининга колоний, как указано в письменном протоколе. С помощью наконечника пипетки возьмите белую бактериальную колонию с чашки и перемешайте ее в 35 µL мастер-смеси для ПЦР-скрининга колоний в ПЦР-пробирке. Приступайте к амплификации суспензии, как описано в тексте; после амплификации ПЦР проведите электрофорез 4 µL продукта ПЦР в 1,5% AGROS геле.

Наконец, отправьте примерно 30 µL ПЦР-продукта для секвенирования пяти результатов колониальной ПЦР на каждый образец. После получения результатов секвенирования можно определить паттерны метилирования: любой исходный цитозин-гуанин, который остался в неизменном виде, был метилирован. Напротив, любой исходный цитозин-гуанин, который стал тимином-гуанином, был неметилирован после проведения вложенной ПЦР-амплификации с использованием праймеров, преобразованных бисульфитом.

Успешность конверсии можно подтвердить, визуализировав фрагмент правильного размера на agarose gel в отдельной метафазе. Два ооцита представляют один родительский аллель и, теоретически, имеют один и тот же паттерн импринтного метилирования. Продукты второго раунда ПЦР можно проверить на наличие непреднамеренного загрязнения.

Рестриктаза, чувствительная к метилированию ДНК, может быть использована для переваривания продукта второго раунда ПЦР, чтобы определить, содержит ли он метилированный или неметилированный аллель. В данном случае происходит расщепление метилированного цитозина в последовательности распознавания фермента. В то время как неметилированный цитозин, преобразованный в тимин, больше не распознается ферментом и не расщепляется, любой образец ооцита метафазы II, содержащий как метилированные, так и неметилированные аллели, следует отбраковать, так как это указывает на контаминацию клетками кумулюса или включение полярного тельца после лигирования и трансформации.

Результаты успешной ПЦР-амплификации колоний можно визуализировать с помощью электрофореза в агарозном геле, чтобы убедиться, что на секвенирование отправлены образцы с продуктом правильного размера. В данном примере ожидаемый размер ампликона после лигирования составляет 56 bp. Здесь клон пять имеет неправильный размер ампликона, поэтому его не следует отправлять на секвенирование.

Секвенирование пяти отдельных клонов из одного ооцита в метафазе II должно дать пять идентичных профилей метилирования и одинаковую степень конверсии не-CpG сайтов. Любые образцы, содержащие более одного профиля, следует отбраковать. Поскольку овулированные ооциты в метафазе II имеют две копии хромосом или прикрепленное полярное тельце, существует вероятность получения двух схожих паттернов последовательностей.

Данные следует исключить для любых цитов с сильно различающимися паттернами метилирования. Поскольку при выполнении данной процедуры нельзя полностью исключить загрязнение клетками кумулюса, важно помнить: во-первых, необходимо несколько раз промыть ооциты в свежей среде после обработки HI IDE, чтобы удалить как можно больше клеток кумулюса. Во-вторых, низкоплавящий агароза затвердевает при температуре ниже 65 °C, поэтому работать следует осторожно, но быстро.

И наконец, поскольку гидросульфат натрия и гидрохинон чувствительны к свету, реакционные пробирки и растворы следует обернуть фольгой.