Понимание мозжечка структурообразования

Я Кэти Миллан, адъюнкт-профессор Чикагского университета на кафедре генетики человека, а также на кафедре неврологии. Я занимаюсь изучением развития мозга, а именно развитием мозжечка — части мозга, расположенной здесь, в задней части черепа.

Эта область мозга наиболее известна своей ролью в развитии моторики, однако выяснилось, что она задействована во многих процессах. Это действительно интересная часть мозга. Формирование паттерна — это развитие определенной структуры в биологической системе. Это одно из тех слов, которые биология развития использует в довольно широком смысле, чтобы обозначить практически что угодно.

И на самом деле не совсем понятно, что это значит. Думаю, каждый биолог по развитию дал бы вам свою версию того, что это означает для меня. Суть в том, как мозг, или, в частности, мозжечок, отличает верх от низа, как определяются левая и правая стороны?

Как определяется, какая часть структуры станет той или иной? И когда эти критические, фундаментальные решения на ранних стадиях эмбрионального развития приняты, как объединить все клеточные структуры для формирования этой изысканно организованной части мозга, которую мы называем мозжечком? Таким образом, нас действительно интересует развитие мозжечка и информационный паттерн в развивающемся мозжечке.

Поскольку мозжечок представляет собой ткань с четко выраженной структурой. В нем не так много клеточных слоев и типов клеток. Таким образом, по сравнению с другими отделами головного мозга, это относительно простая структура.

Кроме того, поскольку мозжечок выполняет очень специфическую функцию (или одну из многих функций), которой является моторная координация, при наличии аномалий мозжечка у мышей или людей одним из результирующих фенотипов становится нарушение координации движений. Таким образом, за более чем сто лет развития генетики мышей было обнаружено и в определенной степени охарактеризовано множество спонтанных мутантов, а также были выделены и сохранены в лабораториях Jackson Labs линии мышей с моторными отклонениями.

И у большого количества этих мышей — я полагаю, более чем у 60 спонтанных линий — наблюдаются нарушения развития мозжечка. Этот ресурс представляет собой очень ценный и богатый материал для изучения механизмов развития, которые определяют формирование структуры мозжечка. Одна из задач, на которой сосредоточена моя лаборатория, заключается в том, чтобы использовать все инструменты, полученные в ходе проекта «Геном человека» и проекта «Геном мыши», и применить эти молекулярные реагенты для поиска генов, которые мутировали у всех этих спонтанных мутантов.

Таким образом, выявляя этих мутантов, мы применяем фенотипоцентрический подход к поиску генов. Мы не выбираем гены случайным образом для их нокаута, а сначала определяем фенотипы и затем ищем соответствующие гены, поскольку такой подход позволяет нам находить гены, которые имеют особое значение для исследуемой системы.

Наша лаборатория, как и многие другие, клонировала ряд таких спонтанных мутантов мышей. И эти спонтанные мутанты мышей позволили открыть действительно интересные биологические закономерности, поскольку мы используем подход, основанный на анализе фенотипа.

Мы не имеем никаких предвзятых представлений о том, какие именно гены нам предстоит обнаружить. Мы не ищем специально аналоги dal ho или мутации каналов. Мы выходим на те гены, которые диктуются фенотипами.

Благодаря этому мы узнаем много нового о биологии. Например, одним из генов или фенотипов, которыми занималась моя лаборатория совместно с коллегой Джимом Линигом, когда я был постдоком, был мышиный мутант, называемый dre, что в переводе с немецкого означает «волчок» или «вращение, как у волчка». Эти мутантные мыши впервые появились в 1929 году в Германии, и их популяция поддерживалась в лабораториях Джексона (Jackson Labs).

Существует несколько аллелей данного конкретного локуса, и было известно, что мозжечок сформировался неправильно. Таким образом, все типы клеток мозжечка присутствовали, но структура мозжечка была аномальной. Средняя часть отсутствовала; эта часть называется вермисом.

И мы обнаружили, что у этих мышей проявлялся ранний эмбриональный фенотип, который приводил к данному фенотипу у взрослых особей. Этот фенотип был результатом мутации в гене под названием LMX1A, что означает «limb homeobox 1». Таким образом, ген LMX1A оказался крайне интересным и важным геном в биологии развития, поскольку он является одним из наиболее критических генов, определяющих, что в центральной нервной системе является «верхом» или дорсальной стороной.

До обнаружения этой редкой мутации никто фактически не знал, за что отвечает данный ген. На самом деле он был обнаружен по другим причинам в инсулин-продуцирующих клетках поджелудочной железы, и другие исследователи изучали его возможную роль при диабете.

Однако на самом деле выяснилось, что ген LMX1A сам по себе не играет никакой роли в развитии поджелудочной железы или развитии островковых клеток. Фактически, его основная роль в развитии заключается в управлении дорсальным паттернированием центральной нервной системы. Когда мы впервые клонировали ген DR, ген LMX1A, мы поняли, что он экспрессируется только в дорсальной части центральной нервной системы.

На самом деле, этот ген экспрессируется не только в дорсальной части центральной нервной системы или в крышной пластинке, которую называют областью вокруг мозжечка. Он экспрессируется в дорсальной части центральной нервной системы на всем протяжении осевой длины эмбриона мыши. Более того, он экспрессируется по всей осевой длине каждого исследованного нами на данный момент позвоночного животного.

И поскольку этот ген экспрессируется дорсально повсеместно, мы предположили, что он должен играть определенную роль в дорсальных отделах других частей центральной нервной системы. Поэтому мы потратили много времени на характеристику фенотипа мышей DR в спинном мозге, так как спинной мозг является гораздо более подходящей модельной системой для понимания развития ЦНС, чем мозжечок, поскольку он гораздо менее сложен с точки зрения трехмерного строения. Его трехмерная структура значительно проще.

Перейдя к изучению цыплят, мы смогли воспользоваться огромным количеством реагентов, чтобы выяснить роль LMX1a в спинном мозге. Затем от спинного мозга мы вернулись к мозжечку. Честно говоря, я считаю, что без технологии электропорации цыплят мы бы не достигли глубокого понимания функций гена LMX1a; именно постдок в моей лаборатории, Виктор Чико, был тем человеком, который фактически реализовал эти эксперименты.

Именно он фактически выяснил функцию гена LMX1A и его основную роль в центральной нервной системе, используя систему электропорации цыплят. Честно говоря, я не думаю, что мы смогли бы достичь такого прогресса без электропорации цыплят. Электропорация цыплят — это действительно ценная технология, поскольку она позволяет быстро осуществлять оверэкспрессию генов в развивающейся нервной системе цыпленка, получать результат после двух или трех дней инкубации и получать фенотипы, пригодные для анализа.

Если бы вы попытались провести генетические манипуляции на мышах для создания трансгенных животных, это заняло бы несколько месяцев, а для создания нокаутов и так далее потребовалось бы как минимум полтора года. Поэтому система развития цыплят является очень ценной, поскольку она позволяет быстро манипулировать экспрессией генов и определять фенотипы. Так, гиперэкспрессия LMX1 в развивающейся нервной системе цыпленка, в частности в развивающемся спинном мозге, привела к тому, что вся дорсальная часть центральной нервной системы или спинного мозга превратилась в дорсальную часть центральной нервной системы или крыловидную пластинку.

Таким образом, эти данные в сочетании с рядом других экспериментов, проведенных Виктором, показали, что LMX1A сам по себе отвечает за запуск всей программы дифференцировки крышной пластинки. Это важно, поскольку крышная пластинка является критическим сигнальным центром в развивающейся нервной системе. При отсутствии крышной пластинки не секретируются морфогены, которые дают сигнал соседним клеткам нервной трубки превращаться в дорсальные сенсорные нейроны.

И без этих сигналов данные клетки переходят в состояние по умолчанию, становясь клетками промежуточного типа. В результате утрачивается большинство дорсальных нейронов в спинном мозге, а также в развивающемся мозжечке. Я полагаю, что мы не смогли бы так легко прийти к такому выводу, используя любую другую систему, кроме нейральной трубки цыпленка.

Нас очень интересует развитие мозжечка не только с точки зрения базовой биологии в системах мышей и цыплят, но и потому, что у людей встречаются пороки развития мозжечка. Эти нарушения развития мозжечка у человека изучены очень плохо. Поэтому в сотрудничестве с моим коллегой, доктором Уильямом Доббинсом, одним из ведущих мировых экспертов по порокам развития человеческого мозга, мы совместно инициировали проект по поиску генов, ответственных за пороки развития мозжечка у людей.

Мы применяем несколько подходов. Одним из наиболее значимых достижений стало создание базы данных ДНК и клинической базы данных, в которую мы включили более 500 пациентов с установленными пороками развития мозжечка у людей; мы собрали изображения МРТ и сопоставили их с образцами ДНК, чтобы использовать этот ресурс для поиска генов, так как оказалось, что пороки развития мозжечка у людей совершенно плохо категоризированы. Честно говоря, я бы сказал, что из каждых 10 снимков, полученных в ходе наших исследований, как минимум один представляет собой порок развития, который никогда ранее не описывался и фактически не был распознан.

Наиболее распространенная и наиболее известная клиницистам порок развития мозжечка у человека называется мальформацией Данди-Уокера. Однако выяснилось, что в мире патологий человеческого мозжечка этот диагноз в некотором роде является «сборным». Многие врачи классифицируют любое отклонение в строении мозжечка как мальформацию Данди-Уокера.

Таким образом, мы набираем пациентов для нашего исследования мальформации Денди-Уокера и обнаруживаем самые разные интересные пороки развития мозжечка. Мы используем этот ресурс для поиска новых генов развития мозжечка, поскольку, с точки зрения биолога развития, люди представляют собой один масштабный эксперимент по мутагенезу. Они являются ценнейшим источником для поиска новых генов развития.

Мы используем несколько подходов для поиска этих генов. Один из таких подходов заключается в анализе генов, роль которых в развитии мозжечка была установлена у мышей, с последующим секвенированием этих генов у людей. В действительности, совсем недавно нам удалось выявить самую первую мутацию в гене LMX1A у человека.

До настоящего времени применение наших фундаментальных исследований в клинической практике было весьма ограниченным. Однако эта ситуация стремительно меняется. По мере обнаружения новых генов мы можем предоставлять семьям детей с данными заболеваниями актуальную информацию для генетического консультирования.

И, честно говоря, именно здесь я вижу наибольшее влияние нашего исследования. Мое видение развития данной области на ближайшие пять лет заключается в том, что будет обнаружено гораздо больше генов как путем характеристики мышиных моделей, так и в результате работы с пороками развития мозжечка у людей. Мы будем больше знать о наборе генов, участвующих в развитии мозжечка.

Далее целью станет выяснение того, как эти гены взаимодействуют друг с другом и как они определяют реальные биологические процессы. Как они управляют всеми различными клеточными событиями, которые происходят при формировании мозжечка? Я считаю, что мозжечок является идеальной моделью для всей центральной нервной системы, так как, по сути, в нем существует всего от пяти до семи основных типов нейрональных клеток.

Все они расположены определенным стереотипным образом. Мы все больше узнаем о молекулах, которые управляют спецификацией и ранней дифференцировкой этих предшественников. Мы все лучше понимаем, как пролиферируют эти клетки.

Полагаю, это произойдет более чем через пять лет, но в конечном итоге я считаю, что в данной области станет возможным проследить весь путь от развития нейронной трубки до развития мозжечка вплоть до достижения его зрелой формы. И я думаю, что поскольку мозжечок представляет собой относительно простую систему, у нас есть надежда действительно выяснить, какие молекулы и события развития управляют формированием всего мозжечка целиком. Я считаю, что это очень важно не только для области генетической диагностики у людей и для изучения развития мозжечка, но и для применения этих механизмов к другим отделам головного мозга.

Мозжечок представляет собой относительно простую структуру, однако многие процессы его развития не являются специфичными только для этой области. Мы можем перенести знания, полученные при изучении мозжечка, на другие, более сложные отделы центральной нервной системы, такие как кора больших полушарий, и, используя изученные механизмы и пути развития, определить, как они применимы к остальным частям головного мозга.