Выборка прав коренных Peptidome Слюна Использование Lollipop, как ультрафильтрация Probe: упростить и улучшить пептида обнаружения клинических масс-спектрометрии
7 августа 2012 г.
Учитывая, слюна выборки для будущего клинического применения, как леденец на палочке, ультрафильтрации (LLUF) зонда было сфабриковано, чтобы уместиться в ротовой полости человека. Прямой анализ слюны на непереваренные NanoLC-КТЛ масс-спектрометрии продемонстрировали способность датчиков LLUF для удаления крупных белков и белков высокой численности и сделать низкими обильные пептиды более обнаружить.
В данном исследовании пептидома слюны используется ультрафильтрационный зонд, напоминающий леденец (LLUF), с последующим анализом методом прямой нано-ЖХ-МС/МС на масс-спектрометре LT Q. Сначала соберите зонд LLUF, используя полиэфирсульфоновую мембрану и этилен-пропиленовую трубку. Затем соберите образцы слюны у добровольцев и пропустите их через зонд LLUF для отбора пробы слюны.
Затем перейдите непосредственно к нано-ЖХ-МС/МС с использованием масс-спектрометра L-C-L-T-Q и проанализируйте данные образцов слюны с применением и без применения зонда LLUF. В конечном итоге пептидом слюны можно получить, анализируя данные L-C-M-S-S и сравнивая идентифицированные пептиды в двух образцах. Данный подход с использованием ультрафильтрационного зонда в форме «леденца» в сочетании с прямым анализом методом нано-ЖХ-МС на приборе LTQ обладает ключевыми преимуществами перед другими методами, такими как расщепление белков слюны до пептидов.
Последующий анализ методом масс-спектрометрии показывает, что устройство LUF PRO упрощает и очищает слюну, а также улучшает детектирование пептидов в цельной слюне для клинического применения. С помощью эпоксидного клея закрепите полиэфирные мембраны по краям треугольных полипропиленовых лопаток. Затем подсоедините трубку из фторированного этилен-пропилена (Тефлон) к цилиндрическому выходу треугольника.
Стерилизуйте полипропиленовые лопатки и зонды 70% спиртом в течение ночи. Чтобы проверить герметичность уплотнения, погрузите зонды LLUF в раствор синего декстрана в концентрации 50 mg/mL на два часа. Подтвердите отсутствие синего декстрана в собранных образцах.
Привлеките в качестве добровольцев здоровых людей в возрасте от 20 до 40 лет. После полоскания рта водой попросите испытуемого собрать образцы цельной слюны в сосуд, охлажденный на льду. Объедините все образцы и храните их на льду.
Сразу после сбора переместите 200 µL слюны в помещение с температурой 4 °C для проведения отбора проб с помощью зондов LLUF. Поместите полиэфирную мембрану в чашку Петри со слюной человека. Создайте отрицательное давление с помощью шприца, чтобы имитировать процесс ультрафильтрации для отбора пробы из слюны.
Далее определите концентрацию белков. Подготовьте образцы белков слюны в концентрации 1 µg/µL для анализа методом нано-ЖХ-масс-спектрометрии. Для анализа образцов используется система Exigent nano LC, сопряженная в режиме онлайн с масс-спектрометром Finnegan LTQ. Сначала с помощью автосамплера нанесите 5 µL непереваренных образцов слюны на колонку-ловушку системы нано-ЖХ.
После этапа промывки переключите клапан и подайте линейный градиент буфера B от 0 до 50% на ловушку и разделительную колонку C 18. Используя режим сбора данных по зависимости (data dependent mode) прибора Excalibur, зарегистрируйте масс-спектры MS/MS для четырех наиболее интенсивных ионов MS с интенсивностью выше 1 × 10⁴. Для каждого образца выполните дублирующие анализы трех различных независимых препаратов.
Затем импортируйте файл с данными в систему Sequester Sorcerer 2, выбрав поиск по соответствующей базе данных белков человека NCBI с использованием неферментной специфичности. После выполнения поиска в Sequester результаты автоматически фильтруются, проверяются и отображаются в профилях пептидов (peptide profit) и белков (protein profit) на основе данных Sequester. Профиль пептидов позволяет оценить комплексный показатель вероятности (P-score), определяющий правильность или ошибочность присвоения пептида, а также предоставляет дополнительную информацию по каждой последовательности пептидов.
Protein profit вычисляет оценку вероятности от нуля до единицы для каждого белка на основе пептидов, назначенных спектрам Ms.Ms. В данном разделе определяется способность зондов LLUF удалять оральные бактерии для последующего культивирования с целью детекции бактерий; образцы слюны до и после сбора зондом LLUF высеваются на чашки с агаром для тестирования аэробных бактерий. Для культивирования аэробных бактерий используйте чашки с агаром LB без антибиотиков при 37 °C в течение одного дня, а для анаэробных бактерий используйте газогенерирующие пакеты (gas pack).
Образец культивировали в бульоне Бру на чашках с агаром в анаэробных условиях при 37 °C в течение одного дня. Создание устройств ультрафильтрации, напоминающих леденец, облегчает отбор проб слюны в имитированной полости рта. В этой системе отрицательно заряженная полиэфирсульфоновая мембрана с пределом отсечения по молекулярной массе 30 кДа приклеена к полипропиленовому основанию и расположена перед зондом LLUF для фильтрации крупных белков слюны.
Для имитации условий полости рта человека с помощью шприца в губку впитывают слюну. Слюна фильтруется и собирается через подключенную трубку. Сравнение жидкостных хроматограмм слюны до и после пробоотбора с помощью LLUF позволило идентифицировать эндогенные пептиды слюны методом нано-ЖХ-МС/МС.
Поскольку эти дифференциальные хроматограммы получены без химического или ферментативного расщепления, они упрощают подготовку проб для клинических целей. В данном образце после анализа LLUF различных белковых составов было выявлено 131 пептид в непереваренной слюне.
Эти пептиды представляют собой фрагменты, производные от различных пролин-богатых белков. Актин, альфа-амилаза, альфа-1-глобин, бета-глобин, гистатин-1, кератин, муцин-7, полимерный иммуноглобулиновый рецептор, серин и S 100. 26 уникальных пептидов, идентифицированных в слюне после фильтрации с помощью зондов LLUF, являются фрагментами, производными преимущественно от различных пролин-богатых белков.
Этот пептид, производный от альфа-амилазы, был обнаружен исключительно в образце слюны, собранном без использования пробников LLUF, что иллюстрирует способность пробников LLUF удалять крупные белки. Что более интересно, после удаления более крупных белков в образцах слюны, полученных с помощью пробников LLUF, было обнаружено несколько пептидных последовательностей; в частности, в образцах после ультрафильтрации пробниками LLUF были идентифицированы пептиды с богатыми пролином С-концами. Теперь вы должны иметь четкое представление о том, как использовать A-L-L-L-L-U-F PRO для подготовки простых образцов слюны для масс-спектрометрии.
Для получения качественного анализа крайне важно собирать образцы слюны в простых и стандартизированных условиях. Я полагаю, что после освоения данной методики процедура может быть надлежащим образом выполнена в течение трех часов. Такой подход с использованием ультрафильтрационного зонда в форме леденца в сочетании с прямым анализом методом nano LC-LT-QMS способствует внедрению биомаркеров в клиническую практику для диагностики заболеваний человека.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается применение ультрафильтрационного зонда в форме леденца (LLUF) для отбора проб слюны, что позволяет повысить эффективность обнаружения малораспространенных пептидов. Зонд LLUF эффективно удаляет крупные и высококонцентрированные белки, обеспечивая возможность прямого анализа методом масс-спектрометрии NanoLC-LTQ.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биохимия
- Аналитическая химия
Введение
- Слюна является ценной биологической жидкостью для клинической диагностики.
- Традиционные методы часто требуют переваривания белков, что осложняет анализ.
- Методы ультрафильтрации позволяют улучшить детектирование пептидов.
- Масс-спектрометрия является мощным инструментом для анализа сложных биологических образцов.
Цель исследования
- Разработать новый LLUF-зонд для отбора проб слюны.
- Повысить эффективность детектирования низкопредставленных пептидов в слюне.
- Сравнить эффективность обработки с помощью LLUF по сравнению с традиционными методами.
Используемые методы
- Изготовление зонда LLUF с использованием полиэфирной мембраны для мобильных телефонов и этилен-пропиленовой трубки.
- Сбор образцов слюны у добровольцев.
- Пропускание слюны через зонд LLUF.
- Прямой анализ образцов с помощью масс-спектрометрии NanoLC-LTQ.
Основные результаты
- Зонды LLUF успешно удалили крупные и высокообильные белки.
- Пептиды с низкой концентрацией стали более заметны после обработки.
- Прямой анализ дал более четкие результаты по сравнению с традиционными методами.
- Данный подход дает значительные преимущества для клинического применения.
Выводы
- Зонд LLUF является перспективным инструментом для анализа слюны.
- Он позволяет улучшить детектирование пептидов без необходимости переваривания белков.
- Данный метод может повысить эффективность клинической диагностики с использованием образцов слюны.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Отбор проб пептидома нативной слюны человека без ферментативного переваривания устраняет критическое препятствие в поиске биомаркеров для клинической масс-спектрометрии. Ультрафильтрационный зонд в форме леденца (LLUF) позволяет напрямую обнаруживать низкокопийные пептиды путем удаления высококопийных белков и примесей, упрощая подготовку образцов для трансляционного применения. Данный подход способствует валидации мишеней на ранних этапах и снижению механистических рисков, обеспечивая воспроизводимый доступ к значимым для заболевания пептидным сигналам в неинвазивной биожидкости.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет исследовать эндогенные пептидные фрагменты, производные от пролин-богатых белков и других компонентов слюны, для проверки гипотез о биомаркерах.
- Практическая ценность: Исключает этапы трипсинолиза и центрифугирования, что снижает преаналитическую вариабельность и ускоряет рабочий процесс от подготовки образца до масс-спектрометрического анализа.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать пептидные профили, обогащенные малопредставленными видами, что повышает чувствительность анализа при выявлении модификаций, связанных с заболеванием.
- Практическая ценность: обеспечивает получение однородных, очищенных от примесей образцов, подходящих для скрининговых исследований методом LC-MS, требующих высокой воспроизводимости.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает мониторинг прогрессирования заболевания путем регистрации нативных пептидных паттернов, отражающих протеолитическую активность в микросреде полости рта.
- Практическая ценность: Позволяет проводить лонгитюдный отбор проб в клинических условиях благодаря минимально инвазивному сбору с помощью зонда, что совместимо с адаптацией для диагностики по месту оказания медицинской помощи.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Зонд LLUF вписывается в континуум открытий — от выдвижения гипотезы до доклинической валидации, особенно в тех случаях, когда требуется разрешение на уровне пептидов в сложных биожидкостях без ферментативной предвзятости.
- Открывающая биология: Облегчает проверку гипотез, обеспечивая доступ к эндогенному пептидому для анализа обогащения путей и деконволюции мишеней.
- Скрининг: Обеспечивает получение воспроизводимых пептидных экстрактов без необходимости фракционирования, что позволяет проводить надежный скрининг соединений или биомаркеров в слюне.
- Аналитика: Позволяет получать количественные данные о пептидах с помощью прямого метода nanoLC-MS, что поддерживает сравнительный анализ в различных условиях или временных точках.
- Трансляционные исследования: Соответствует принципу непрерывности биомаркеров за счет выделения клинически значимых пептидов, обнаруживаемых в неинвазивных жидкостях.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой модульный интерфейс отбора проб, который можно адаптировать для различных исследований слюны с целью масштабируемого внедрения на этапах поиска и валидации.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования при детектировании пептидов за счет снижения сложности образца и минимизации потерь малопредставленных видов.
- Эксплуатационная ценность: Стандартизирует отбор проб слюны с помощью закрытого процесса ультрафильтрации с использованием шприца, не зависящего от центрифугирования.
- Стратегическая ценность: Снижает частоту технических сбоев при поиске биомаркеров на основе масс-спектрометрии, повышая эффективность принятия решений о продолжении или прекращении разработки на ранних этапах.
- Влияние на портфель: Обеспечивает стратифицированное по риску продвижение кандидатов в слюнные биомаркеры за счет повышения качества и воспроизводимости данных.
Особенности реализации
- Требуется опыт в сборке зондов, работе со слюной и эксплуатации системы nanoLC-MS.
- Зависит от наличия ультрафильтрационных мембран с определенным MWCO и биосовместимых трубок для орального использования.
- Необходимы стандартизированные протоколы забора образцов у добровольцев, стерилизации зондов и валидации блокировки (например, методом исключения синего декстрана).
- Требует учета особенностей адаптации к различной вязкости слюны, скоростям потока и индивидуальным характеристикам доноров.
- Ограничено пределом молекулярно-массового отсечения мембраны, что может привести к исключению определенных пептидно-белковых комплексов или более крупных биомаркеров.
