Микродиализ этанола в течение оперантного этанола самоуправления и определение этанола методом газовой хроматографии

Общая цель данной процедуры — мониторинг уровней этанола в диализате мозга во время сеанса самовведения этанола. Чтобы сопоставить этот показатель с синхронным поведением при самовведении, сначала хирургическим путем имплантируют направляющую микродиализа, канюлю и фиксирующий болт, а затем обучают крыс оперантному самовведению этанола. Вторым этапом является привыкание крыс к фиксирующему устройству головного модуля, чтобы оно не препятствовало самовведению этанола во время микродиализа.

Затем в ходе сеанса самовведения этанола проводится микродиализ, в процессе которого подготавливают часть диализата для анализа на содержание этанола. Далее образцы диализата анализируют на концентрацию этанола с помощью газового хроматографа с пламенно-ионизационным детектором. В конечном итоге полученные результаты демонстрируют временную динамику поступления этанола в интересующую область мозга во время сеанса самовведения этанола.

Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как пункция хвостовой или сафенальной вены, является то, что эта процедура оказывает минимальное воздействие на животное в момент забора проб и позволяет измерять концентрацию препарата в интересующей области мозга в динамике, пока животное выполняет поведенческий тест. Как правило, новичкам этот метод дается с трудом, поскольку он требует ряда специализированных навыков, многие из которых можно приобрести только путем многократной практики или опыта. Демонстрацию процедуры проведет Джеффри Дилли, студент-исследователь нашей лаборатории.

Все продемонстрированные процедуры с животными одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Техасского университета и соответствуют всем правилам руководства по уходу и использованию лабораторных животных. Техасский университет в Остине является аккредитованным центром ALAC; в данных экспериментах по поведенческому микродиализу используются крысы линии Long Evans, которым хирургическим путем была имплантирована канюля 21 G над интересующей областью мозга. Всем животным должен быть обеспечен период послеоперационного ухода и восстановления продолжительностью не менее одной недели; перед началом следующих процедур животные должны быть здоровы.

Поместите крысу в оперантную камеру Med Associates, оснащенную выдвижным рычагом Lichter и трубкой-дозатором, и обучите животное нажимать на рычаг для получения 10% раствора сахарозы. После того как крыса будет обучена реагировать для получения раствора сахарозы, начните соответствующий график обучения, при котором этанол постепенно добавляется в раствор в течение нескольких сеансов питья накануне предпоследнего оперантного сеанса. После анестезии животного и проверки уровня седации прикрепите пружину фиксатора к болту фиксатора на головном модуле крысы, чтобы приучить её к аппаратуре, состоящей из уравновешивающего рычага, плеча, поворотного фиксатора, пружины и штатива с кольцами.

Позвольте крысе провести ночь в операционном зале в домашней клетке с доступом к еде и воде, а затем на следующий день проведите тренировочную сессию с использованием фиксатора и сопутствующего оборудования за день до начала эксперимента по микродиализу. После наркоза крысы изофлураном проверьте глубину седации с помощью щипкового теста и введите микродиализный зонд, перфузируемый искусственной цереброспинальной жидкостью. Надлежащим образом зафиксируйте зонд, затем установите скорость потока зонда на 0.2 µL в минуту.

Поместите крысу в домашнюю клетку в комнате для оперантного обусловливания на ночь; при этом все оборудование для диализа должно быть установлено, а корм и вода должны предоставляться в свободном доступе. На следующий день после установки зонда, как минимум за два часа до начала эксперимента, увеличьте скорость потока зонда до рабочего значения. С помощью шприца Hamilton убедитесь, что скорость потока зонда стабильна и составляет не менее 90% от заданной скорости потока.

При оценке содержания нейромедиаторов в диализных пробах проводите отбор проб на всех этапах эксперимента. Начните со сбора диализных проб, пока животное находится в домашней клетке. Храните пробы надлежащим образом для последующего анализа.

Осторожно перенесите крысу в оперантную камеру и запустите программу управления камерой. Продолжайте отбор проб, пока крыса ждет выдвижения рычага в камеру, до момента выдвижения рычага за две пробы. Начните отбор части каждой пробы диализата для анализа на содержание этанола, перенося подходящую аликвоту диализата в стеклянный флакон объемом два миллилитра; быстро закройте флакон с пробой этанола герметичной септой и зафиксируйте ее с помощью зажима.

Поскольку этанол летуч, а объем образца невелик, непоследовательная или медленная подготовка проб приведет к недостоверным результатам. Сохраните остаток для анализа нейромедиаторов. 20-минутный период питья начинается после того, как компьютерная программа Med Associates выдвигает рычаг в камеру и крыса нажимает на него, чтобы получить доступ к бутылке с раствором для питья.

Продолжайте отбирать пробы на протяжении всего периода приема напитка; по завершении этого периода компьютерная программа извлекает флакон из камеры. Оставьте животное в камере еще на 20 минут после окончания приема напитка в завершение эксперимента по микродиализу. После анестезии крысы извлеките зонд.

Если гуманная эвтаназия животного не проводится немедленно, установите обтуратор для обеспечения визуализации тракта зонда. Извлеките мозг в течение трех дней после эксперимента. Проанализируйте образцы вместе с внешними эталонами этанола с помощью газового хроматографа с пламенно-ионизационным детектором, автосамплером для анализа паровой фазы (headspace), нагретым до 50 °C, и капиллярной колонкой с гелием в качестве подвижной фазы.

Для записи и анализа хроматограмм используйте программное обеспечение хроматографической станции, чтобы подготовить систему к анализу этанола. Используйте рециркуляционную водяную баню для нагрева планшета автосамплера и откройте баллоны с воздухом и водородом. Затем запустите программу старта.

Когда прибор будет готов, запустите 20-минутный обжиг для деконтаминации волокна. Приготовьте стандарты, используя мерную колбу объемом 100 мл, чтобы разбавить 238 µL 95% ethanol водой до конечного объема 100 мл. Для создания серии стандартов используйте метод последовательного разведения один к одному.

Перенесите стандарты пипеткой в стеклянные флаконы и загерметизируйте их точно так же, как при подготовке образцов. Обязательно проведите анализ холостой пробы с водой вместе со стандартами. Поместите стандарты и образцы в лоток автосамплера и нагревайте их до полного испарения всей жидкой аликвоты.

Для анализа стандартов и образцов создайте список образцов, указав, в каком слоте автосамплера находится каждый образец, и отметив, что каждый образец должен быть проколот. Направьте файлы данных в выбранную папку, выберите подходящий метод анализа для образцов и запустите выполнение. После того как система обработает все образцы, убедитесь, что программа корректно интегрировала каждый пик.

Постройте график зависимости высоты пика от каждого известного внешнего стандарта. Концентрация этанола. Используйте линейную функцию, определенную по этим точкам, для интерполяции концентрации этанола в каждом образце диализата.

На данном рисунке представлены примеры хроматограмм для трех концентраций стандартных растворов этанола и одна хроматограмма образца диализата крысы, отобранного в конце сеанса самовведения этанола. Пики этанола должны быть относительно симметричными, иметь стабильное время удерживания и отношение сигнал/шум более 10. Несоответствие этим критериям означает необходимость технического обслуживания системы; при качественном проведении хроматографии и использовании правильных стандартов получается линейная градуировочная кривая, которая применяется для расчета концентрации этанола в образцах диализата, собранных у животных в течение курса самовведения этанола.

Полученные концентрации этанола в диализате не скорректированы с учетом восстановления зонда in vivo и составляют лишь часть концентрации этанола в тканях мозга. Если требуется количественный микродиализ этанола, необходимо экспериментально определить фракцию извлечения этанола, диффундирующего из внеклеточного пространства в зонд. При должном освоении эта методика занимает примерно четыре-пять часов при правильном выполнении.

Этот показатель будет варьироваться в зависимости от продолжительности поведенческого сеанса. Успешное завершение этапа микродиализа в эксперименте во многом зависит от качества подготовительных фаз. При выполнении данной процедуры важно убедиться, что крысы привыкли к манипуляциям и что вы адаптировали их к любым возможным отвлекающим стимулам, которые могут возникнуть во время эксперимента с диализом, чтобы поведение животного по самовведению препарата не изменилось.