Определение летучих Обонятельные с помощью газовой хроматографии-Multi-единицы Recordings (ГКХ) в усиков насекомого Lobe

Общая цель данной процедуры заключается в идентификации биологически активных одорантов в сложных смесях с помощью регистрации активности в головном мозге шмеля. Это достигается путем первоначального сбора поведенчески активных смесей, а затем подготовки газового хроматографа и многоканальных систем регистрации для проведения эксперимента. Третьим этапом является подготовка и диссекция головного мозга шмеля для нейронной регистрации в антеннальных долях грибовидных тел.

Затем проводится эксперимент, при котором электроды вводятся в лопасть антенны, и измеряются ответы на подаваемые летучие вещества путем анализа нейронной активности в ответ на сложные смеси и их отдельные компоненты. С помощью этого метода можно идентифицировать биологически активные одоранты, выделенные методом газовой хроматографии. Таким образом, основным преимуществом данной методики по сравнению с другими методами, такими как G-C-E-A-G, является чувствительность нейронов антенн и возможность охарактеризовать реакцию нейронов мозга на специфические летучие вещества цветов.

Визуальная демонстрация данного метода имеет критическое значение, поскольку совмещение электрофизиологических и химико-аналитических этапов затруднено из-за сложности техники записи электрофизиологических сигналов и необходимых шагов по сбору летучих веществ из надголовного пространства. Хотя эта методика позволяет изучить особенности обонятельной обработки информации у шмелей, она также может быть применена к другим системам, таким как переносчики заболеваний (например, комары или триатомовые клопы) или сельскохозяйственные вредители (например, тля или мотыльки). Для выполнения данной процедуры подготовьте электрод сравнения из вольфрамовой проволоки, установленный на микроманипуляторе.

Микроманипулятор оснащен многоканальным электродом, таким как спиралевидный провод, tede или кремниевый многоканальный электрод, подключенным к предусилителю; также имеется газовый хроматограф с выходом на экранированный разъем BNC на столе. Выход детектора ГХ сопряжен с усилителем и системой сбора данных таким образом, чтобы нейронные сигналы и сигналы ГХ были синхронизированы. В данном примере в качестве газа-носителя ГХ используется гелий, а разделение проводится в колонке ГХ DB-5.

ГХ оснащена инжектором с делителем потока, температура которого установлена на 200 °C, и пламенно-ионизационным детектором с температурой 230 °C. После нагрева образцов в ГХ поток из колонки разделяется в соотношении 1:1 между пламенно-ионизационным детектором и антенной B с помощью стеклянного Y-образного соединителя. В данном примере ГХ используется для подачи летучих веществ, собранных методом динамической абсорбции из цветков Mimus lewisii, высокогорного дикорастущего цветка, произрастающего в Калифорнии.

В качестве альтернативы вместо использования газового хроматографа можно подавать отдельные летучие соединения или их смеси с помощью воздушных импульсов. Подача осуществляется с помощью отдельного стеклянного шприца, в котором находится фрагмент фильтровальной бумаги с нанесенными на нее соединениями. Воздушные импульсы отводятся из постоянного потока воздуха с помощью управляемого компьютером соленоидного клапана.

Начните подготовку с того, что отрежьте около одного сантиметра от конца наконечника дозатора объемом 1 мл. Поместите шмеля в основание наконечника и осторожно протолкните его к противоположному концу так, чтобы снаружи осталась только голова. С помощью расплавленного стоматологического воска сформируйте форму вокруг открытой части головы.

Воск должен плотно прилегать к сложным глазам для полной иммобилизации головы, однако, при необходимости, он не должен касаться антенн. Для фиксации антенн используйте маленькие булавки. Затем с помощью острого лезвия, например микроскальпеля, сделайте в головной капсуле разрез в форме квадратного окна.

Начните делать разрез непосредственно за антенной и рядом с одним из фасеточных глаз. Проведите разрез по прямой линии между глазами. Затем сделайте разрез в дорсальном направлении до места изгиба головной капсулы в сторону груди.

Продолжите разрез до противоположного конца головной капсулы. В завершение сделайте разрез обратно к начальной точке, чтобы formed квадрат. С помощью пинцета удалите кутикулу.

Кутикулу, прилегающую к антенне, необходимо удалить, иначе она будет препятствовать введению электрода сразу после обнажения мозга. Немедленно промойте ткань физиологическим раствором для насекомых. Убедитесь, что доли антенн хорошо обнажены.

Затем с помощью очень тонкого пинцета осторожно удалите периневральную оболочку непосредственно над лопастями антенн. Будьте предельно осторожны, чтобы не проколоть мозг пчелы пинцетом. Теперь препарат пчелы готов к электрофизиологической регистрации.

Начните с закрепления подготовленной пчелы в зажиме, зафиксированном на магнитном основании. Поддерживайте перфузию физиологическим раствором для насекомых, подаваемым из резервуара с контроллером потока. Затем введите референсный электрод в ткань головного мозга с противоположной стороны.

Затем введите многоканальный электрод в доли антенн пчелы. После размещения электродов подождите от 30 до 60 минут до стабилизации записей.

В течение этого времени подготовьте данные по внеклеточным спайкам нейронов, также применив пороговую фильтрацию. Для некоторых каналов записи может потребоваться ручная установка порога из-за наличия шумов. Затем убедитесь, что температурный градиент газохроматографического анализа установлен верно.

В данном примере температура начинается с 50 °C и поддерживается в течение четырех минут, затем увеличивается на 10 °C в минуту до конечной температуры 220 °C, либо поддерживается на этом уровне в течение шести минут. Когда формы волн единиц в каналах записи становятся согласованными, нейронные записи считаются стабильными. После стабилизации заполните шприц ароматом из надгазового пространства цветков и введите аромат в порт для ввода пробы в голову gc.

Затем, сразу после завершения анализа на ГХ, начните запись сигналов с электродов. Оставьте препарат отдохнуть от 5 до 15 минут. После этого либо введите другой образец в ГХ, либо стимулируйте препарат, используя отдельные летучие соединения или их смеси.

Если в любой момент спонтанная активность внезапно прекратится или изменится, проверьте подачу физиологического раствора и дайте препарату отстояться в течение 15 минут. Если после этого активность не восстановится до прежнего уровня, препарат следует утилизировать. По окончании эксперимента зафиксируйте мозг, не извлекая зонды из ткани, затем извлеките мозг, удалите фиксатор и проведите дегидратацию ткани мозга.

Затем расположение регистрирующих каналов можно определить с помощью конфокальной микроскопии по аромату цветков мимуса Luci. Общее количество летучих веществ, определяемых с помощью ГХ, обычно составляет от 60 до 70 соединений.

Аромат Mimus Luci преимущественно состоит из монотерпеноидов, включая бета-миозин и альфа-пинин. Остальная часть аромата представлена шестиуглеродными летучими соединениями. Несколько препаратов стимулировали с помощью 3 µL экстракта из глаз Mimus Lewis.

Эта запись одного из восьми нейронных блоков, зарегистрированных многоканальным электродом, демонстрирует селективность отклика нейрона на определенные летучие вещества. В данном примере показано соединение dine. Ниже представлены ответы восьми нейронных блоков.

Примерно половина ансамбля не проявила отклика. Это вызывает удивление, учитывая разнообразие летучих соединений, выделяемых из пространства над цветком, однако такие результаты воспроизводятся в разных препаратах и подтверждаются другими исследованиями. Нормированная частота разрядов реагирующих единиц указывает на выраженную селективность к определенной группе одорантов.

Одоранты, отмеченные стрелками, вызвали наиболее выраженные реакции. Это демин и транс-бета-осаин. Таким образом, после просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготовить насекомое к эксперименту, а затем провести сам эксперимент с использованием газовой хроматографии с многоканальной записью.

Таким образом, цель состоит в том, чтобы выявить предполагаемые поведенчески эффективные одоранты в сложном букете запахов. При должном соблюдении данной процедуры и наличии соответствующего навыка выполнение этой техники занимает от двух до трех часов. Для полного определения эффективности летучих веществ в опосредовании поведенческого ответа насекомого могут быть проведены другие методы, такие как поведенческое тестирование с выявленными одорантами.