Количественные оценки миграции клеток в Phagokinetic анализа подвижности трек

Общая цель данной процедуры — обеспечить возможность количественного измерения клеточной подвижности во времени с помощью анализа подвижности клеток на основе золотых наночастиц. Для этого сначала подготавливают стеклянные покровные стекла для нанесения покрытия из золотых наночастиц. В частности, безэндотоксинные покровные стекла покрывают желатином, а затем подвергают запеканию.

Второй этап заключается в восстановлении хлорозолистой кислоты, в результате чего образуются наночастицы золота, и в равномерном нанесении этого раствора на покрывные стекла, предварительно обработанные желатином. Затем клетки помещают на покрывные стекла с наночастицами золота на время, предусмотренное протоколом эксперимента. Далее желатин вытесняет наночастицы золота, создавая дорожки.

Заключительным этапом является мониторинг и количественная оценка подвижности клеток с помощью микроскопии для визуализации дорожек, оставляемых перемещающимися клетками. В конечном итоге выполняется измерение площади этих дорожек с использованием бесплатного программного обеспечения. Одним из главных преимуществ данной методики перед существующими методами, такими как таймлапс-съемка (time lapse imaging), является то, что данный анализ требует наличия только стандартного светового микроскопа, стандартной камеры и использования бесплатного ПО для обработки изображений.

Кроме того, данный анализ позволяет легко проводить исследование и сравнение множества образцов с использованием метода, подходящего для высокопроизводительного скрининга. Хотя этот метод позволяет получить представление о влиянии различных физиологических факторов и движении клеток, его также можно применять к другим системам, например, при изучении влияния патогенов на подвижность инфицированных клеток. Как правило, новичкам в этом методе может быть сложно, так как процедура требует строгого соблюдения объемов и температур, указанных в протоколе.

В данном протоколе особое внимание уделяется оценке цвета конечного раствора осажденных наночастиц золота для подтверждения успешности процедуры. Визуальная демонстрация этого метода имеет критическое значение, так как этапы анализа подвижности кинетического трека FGO сложно освоить самостоятельно.

Они включают несколько процедур, которые редко используются в лабораториях клеточной и молекулярной биологии. Для подготовки покровных стекол с желатиновым покрытием сначала суспендируйте желатин в деионизированной воде для получения раствора с конечной концентрацией 0.5 grams на 300 milliliters, затем автоклавируйте смесь в течение 15–30 минут. Важно выполнить эту процедуру в течение двух часов после добавления желатина в ламинарном шкафу для культивирования тканей.

Подготовьте покровные стекла для нанесения покрытия, перенеся восемь или девять промытых кислотой покровных стекол в пластиковую чашку диаметром 100 мм. Убедитесь, что стекла не касаются друг друга и стенок чашки. Осторожно нанесите пипеткой по две-три капли желатина на каждое покровное стекло, избегая перелива на поверхность чашки.

Затем поместите чашку с покровными стеклами, покрытыми желатином, в oven и выдержите при температуре 90 °C в течение 10 минут. По истечении 10 минут извлеките чашку из oven и верните ее в tissue culture hood.

Осторожно удалите излишки желатина с помощью пипетки. Поместите чашку обратно в oven и высушите покровные стекла при 70 °C в течение 45 минут. После высыхания покровных стекол извлеките чашку из oven и перенесите ее обратно в вытяжной шкаф для कल्चर ткани.

Осторожно приподнимите один край покровного стекла с помощью стерильной иглы. Затем, используя стерильный пинцет, извлеките покрытые желатином покровные стекла из чашки и поместите их в отдельные лунки планшета на 24 лунки. Следующим шагом является подготовка покровных стекол с коллоидным золотом.

Начните с приготовления 10 мл 0,5% раствора цитрата натрия, работая в ламинарном шкафу для культур тканей, смешав 1,5 мл 14,5 мМ раствора хлорзолевой кислоты (chloro ORIC acid) и 13,5 мл автоклавированной деионизированной воды в стерильной колбе Эрленмейера, свободной от эндотоксинов. На каждые восемь-девять покровных стекол должен получиться раствор бледно-желтого цвета. Хлорзолевая кислота токсична, поэтому при работе с ней следует соблюдать осторожность. Она также чувствительна к свету, поэтому этап кипячения следует проводить в условиях низкой освещенности.

Когда раствор достигнет температуры кипения, снимите колбу с нагревательной плитки и перенесите ее на магнитную мешалку. Чтобы сформировать коллоидные частицы золота в растворе, при перемешивании добавьте 0,7 мл 0,5% раствора цитрата натрия на каждые 15 мл раствора хлорозолевой кислоты; продолжайте перемешивание примерно в течение двух минут. За это время цвет раствора изменится с бледно-желтого на прозрачный, затем на серый, пурпурный и, наконец, на темно-пурпурный.

Перед тем как раствор окончательно приобретет цвет красного вина или, что предпочтительнее, ржавый цвет, наберите коллоидный раствор золота в пипетку объемом 10 мл и дайте ему остыть в пипетке в течение одной-двух минут до достижения комнатной температуры. Затем нанесите от 0,5 до 1 мл раствора на покрытые желатином покровные стекла в 24-луночном планшете. Поместите 24-луночный планшет с покровными стеклами, покрытыми коллоидным золотом, в инкубатор при температуре 37 °C и инкубируйте в течение 30 минут. После того как частицы успеют осесть на покрытые желатином покровные стекла, проверьте их плотность под световым микроскопом.

Надлежащее распределение наночастиц золота позволяет легко и эффективно определять границы траекторий движения клеток. Оптимальная плотность варьируется в зависимости от размера клеток. Слишком высокая концентрация частиц золота препятствует перемещению клеток, в то время как слишком низкая концентрация частиц золота ограничивает возможность точного определения траектории подвижности.

По этой причине в отдельных экспериментах следует использовать только те покровные стекла, которые были изготовлены в одной партии или имеют подтвержденную одинаковую плотность. Если концентрация частиц золота недостаточна, добавьте к покровным стеклам с желатиновым покрытием еще 0,5–1 мл раствора коллоидного золота. Если же концентрация частиц золота слишком высока, как показано в данном случае, единственным эффективным решением будет повторное приготовление раствора коллоидного золота и покрытие новых покровных стекол.

Если плотность частиц соответствует требуемой, верните планшет в инкубатор при 37 °C и инкубируйте от одного часа до ночи. Затем удалите несвязавшиеся частицы золота, трижды погрузив покровные стекла в стерильный фосфатно-солевой буфер. После этого храните покрытые коллоидным золотом покровные стекла в лунках чистого 12-луночного планшета, заполненных PBS, при температуре 4 °C до момента использования. Не допускайте высыхания покровных стекол; используйте их в течение двух-трех месяцев с даты изготовления.

Следующим шагом является подготовка покровных стекол с коллоидным золотом для клеточной культуры. Начните с их размещения в отдельные лунки планшета на 24 лунки, в которые перед добавлением покровных стекол было внесено примерно 0,3 мл культуральной среды. Перенесите примерно от 5 000 до 50 000 клеток на каждое покровное стекло с коллоидным золотом. Количество клеток будет зависеть от типа клеток, однако плотность посева должна быть достаточно низкой, чтобы предотвратить перекрытие траекторий движения нескольких клеток в одной области.

Накройте планшет и поместите его в инкубатор при 37 °C с 5% carbon dioxide на период от 6 до 24 часов. В зависимости от подвижности конкретного типа клеток, оптимальное время инкубации следует определить экспериментально для каждого типа клеток. После инкубации зафиксируйте те покровные стекла, которые не будут анализироваться немедленно: сначала дважды окуните их в PBS, затем инкубируйте в 3% para formaldehyde в течение 15 минут при комнатной температуре. С помощью микроскопа сделайте снимки траекторий, оставленных одной движущейся клеткой на нефиксированных или фиксированных покровных стеклах. Увеличение, используемое для фотографирования клеточных траекторий, варьируется в зависимости от типа клеток. Тем не менее, во всех исследованиях необходимо использовать одинаковое увеличение, чтобы иметь возможность сравнивать результаты.

Для моноцитов хорошо подходит 40-кратное увеличение; используя бесплатное программное обеспечение, такое как ImageJ, NIH Image или Image Tool, определите среднюю площадь коллоидного золота, очищенную 10–20 или более клетками для каждого образца. На представленных здесь полученных изображениях показан путь очистки частиц коллоидного золота одним нестимулированным моноцитом, снятый с помощью 40-кратного объектива. Неподвижные клетки создают характерные небольшие овальные или круглые дорожки вокруг себя, что указывает на низкий базальный уровень движения. Напротив, высокоподвижные клетки характеризуются направленным движением в виде удлиненных треков и более обширными общими областями из-за их неправильной формы.

Траектории движения клеток лучше всего анализировать с помощью инструмента «freehand» в программном обеспечении Image J для выделения их объема. Затем количественные измерения площади можно выполнить с помощью инструмента «measure» в меню анализа Image J. При выполнении данной процедуры важно строго соблюдать объемы и температуры, указанные в протоколе, так как отклонения могут существенно повлиять на конечные результаты. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как создавать покровные стекла с желатиновым покрытием, как готовить наночастицы золота и покровные стекла с покрытием из наночастиц золота, а также как отслеживать и количественно оценивать движение клеток с помощью световой микроскопии.

Не забывайте, что работа с кипящими растворами на плитке, особенно с парами кипящего раствора фтористоводородной кислоты и цитрата натрия, может быть опасна; при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как работа в вытяжном шкафу и соблюдение техники безопасности.