Простой протокол для извлечения Гемоциты от диких гусениц

Общая цель данной процедуры заключается в извлечении, визуализации и подсчете гемоцитов из диких гусениц. Для этого сначала гусеницу анестезируют, поместив ее на лед, затем вводят буферный раствор, содержащий антикоагулянт, и снова помещают гусеницу на лед, чтобы гемоциты вернулись в кровоток перед извлечением. На втором этапе с помощью чистого скальпеля делают неглубокий надрез на заднем конце гусеницы.

Затем гусеницу осторожно сжимают с помощью мягких пинцетов. После этого смесь буферного раствора и гемолимфы аспирируют с помощью микропипетки и собирают в микроцентрифужную пробирку. На заключительном этапе раствор гемолимфы осторожно перемешивают с равным объемом буферного раствора и переносят 10 µL полученного раствора на гемоцитометр для визуализации и подсчета количества гемоцитов.

В конечном итоге данный метод выделения гемоцитов может быть использован в качестве быстрого и эффективного способа подсчета гемоцитов у различных видов гусениц, а также в качестве инструмента для изучения физиологических аспектов клеточного иммунного ответа насекомых. Основным преимуществом данной методики является возможность выделения гемолимфы у гусениц с очень коротким брюшком. Другие модели гусениц подвергаются кровопусканию путем разрезания одного из сегментов брюшка с последующим выделением гемоцитов из вытекающей жидкости.

Кроме того, данный метод может быть использован для выделения гемолимфы у других видов насекомых. Этот подход позволяет ответить на ключевые вопросы в области экоиммунологии, например, о том, как клеточный иммунный ответ насекомых изменяется в зависимости от качества рациона, стадии развития или воздействия различных патогенов. Чтобы приступить к данной процедуре, анестезируйте личинок предпоследнего возраста, выдержав их на льду в течение 20 минут перед экстракцией гемоцитов.

После этого вставьте тупой конец чистой капиллярной иглы калибра 16 в трубку, соединенную со стеклянным шприцем объемом 20 мл. Оставьте пробирку с собирающим раствором открытой на лабораторном столе. Медленно заполните капилляр примерно 10–15 µL буфера.

Затем положите иглу на комок глины, расположенный рядом с диссекционным микроскопом. Поместите гусеницу в чашку Петри. Насекомое должно лежать на боку так, чтобы сфероиды были отчетливо видны.

При просмотре под диссекционным микроскопом удерживайте гусеницу пинцетом и поднесите иглу к одной из сферических сегментов, где кутикула насекомого обычно более мягкая. Затем осторожно прижмите капиллярную иглу к телу насекомого. После того как игла проколет кутикулу, введите весь объем раствора в гусеницу.

После инъекции тело гусеницы может раздуться, но оно не должно лопнуть или начать подтекать. Верните гусеницу в охлажденную чашку Петри. Расположите насекомое спиной вверх, чтобы предотвратить вытекание буфера из раны.

Повторите инъекции для каждой гусеницы, используемой для экстракции гемолимфы. Затем оставьте всех насекомых охлаждаться на льду в течение 30 минут. Теперь поместите гусеницу в чашку Петри под диссекционный микроскоп.

Осторожно сделайте неглубокий разрез длиной около двух-трех миллиметров в задней части гусеницы, используя стерильный скальпель, не повреждая кишечник или другие внутренние органы. Затем аккуратно сожмите гусеницу гибкими пластиковыми пинцетом, собирая примерно 10–20 µL гемолимфы наконечником дозатора объемом 10 µL. Снова будьте осторожны, чтобы не повредить внутренние ткани.

После этого удалите остатки гусениц. Соберите гемолимфу из каждой гусеницы в отдельные промаркированные силиконизированные микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл. Затем добавьте примерно 10–20 µL инкубационного раствора в каждый образец гемолимфы, собранный от отдельной гусеницы.

На данном этапе постоянно держите образцы гемолимфы на льду. Смешайте образец гемолимфы с инкубационным раствором непосредственно перед подсчетом гемоцитов.

Данная обработка обеспечивает надлежащее разделение гемоцитов и предотвращает их склеивание. Используя чистый наконечник дозатора, перенесите 10 µL образца гемолимфы, смешанного с инкубационным раствором, на гемоцитометр. Затем с помощью светового микроскопа подсчитайте и зафиксируйте количество гемоцитов как минимум в 15 больших квадратах центральной сетки гемоцитометра.

Сложите эти значения, чтобы получить общую сумму количества гемоцитов в 15 квадратах. Затем тщательно промойте гемоцитометр и предметное стекло-крышку, используя промывочную бутылку с дистиллированной и деионизированной водой. После этого протрите их насухо салфетками Kim wipes.

Повторите данные процедуры для остальных образцов гемолимфы и рассчитайте среднее количество гемоцитов на миллилитр объема гемолимфы для каждой гусеницы. На изображении, полученном с помощью микроскопии в светлом поле, показаны выделенные гемоциты гусениц nucle hin ai при 20-кратном увеличении. После выполнения данной процедуры собранные гемоциты можно использовать для изучения клеточного иммунного ответа и проведения таких анализов, как фагоцитоз, капсулирование и определение активности pH-оксидазы.

Кроме того, неиспользованные РНК, ДНК и белки могут быть собраны для последующих анализов с целью изучения этих клеточных иммунных ответов у насекомых. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как делать инъекции гусеницам для извлечения гемолимфы и как собирать гемолимфу, содержащую живые гемоциты.