ПЦР-метод генотипирования различать дикого типа и декоративных многообразия Императы цилиндрической

Основная цель данной процедуры — предоставить экономически эффективный и экспресс-протокол молекулярного генотипирования, позволяющий дифференцировать сорта Retta cylindrica, обычно называемой гон-травой, которые невозможно различить только по морфологическим признакам. Это достигается путем предварительного выявления и выделения тканей интересующего сорта гон-травы. Следующим шагом является экстракция ядерной и плазмидной ДНК из собранных тканей.

Затем проводится полимеразная цепная реакция (ПЦР) выделенной ДНК с использованием сорт-специфичных праймеров, нацеленных на различия в последовательностях региона turn LF в PLA, а также соответствующих положительного и отрицательного контролей. Заключительным этапом является проведение гель-электрофореза каждой из четырех ПЦР-реакций для визуализации амплифицированных продуктов ПЦР. В итоге сорт собранной гон-травы определяется путем анализа полученных сорт-специфичных полос продуктов ПЦР на геле. Инвазивные растения ежегодно обходятся Соединенным Штатам примерно в 3,4 миллиарда, нанося существенный вред как сельскохозяйственным, так и природным ресурсам.

Дикий тип Imperata cylindrica, также известный как трава Коган, входит в десятку самых опасных инвазивных сорняков в мире. Трава Коган быстро распространяется, образуя монокультуры, которые вытесняют местную растительность и, следовательно, животных, зависящих от этой растительности. В настоящее время эта трава занимает 490 миллионов гектаров по всему миру и около 500 000 гектаров в Соединенных Штатах. Декоративный сорт Imperata cylindrica широко продается под названиями Imperata cylindrica, Arbra, красный барен и японская кровавая трава, которую мы будем называть JBG. Этот сорт предположительно стерилен, неинвазивен и считается привлекательным благодаря своим красным листьям.

При определенных условиях японская кровавая трава может производить жизнеспособные семена и возвращаться к полностью зеленой форме, которая неотличима от дикого типа травы коган. Как видно, оба варианта имеют зеленые листья и отличаются более крупным размером и более широкими листьями по сравнению с традиционным декоративным сортом. Кроме того, ревертированные растения и растения дикого типа обладают более крупными корневищами, что увеличивает их потенциал бесполого размножения по сравнению с декоративным сортом.

Обратная гибридизация делает идентификацию только по морфологии сложной задачей. Молекулярные методы позволяют точно различать инвазивные растения и растительные материалы, которые невозможно идентифицировать с помощью обычного визуального осмотра.

Молекулярные методы имеют решающее значение для защиты от распространения и внедрения инвазивных растений. Применение данного молекулярного протокола позволяет точно отличить реверсии японской кровавой травы от травы Когана. Этот протокол может помочь предотвратить совместное произрастание с травой Когана и возможное образование жизнеспособных гибридов.

Основным преимуществом данного метода перед существующими техниками, такими как анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP) или секвенирование ДНК, является то, что он представляет собой очень экономичный и быстрый способ молекулярного генотипирования, позволяющий легко отличить коганскую траву дикого типа от сортов японской кровавой травы. Демонстрацией метода выступит Джозеф Хери, студент нашего лабораторного отделения. Сначала выберите образец с участка, где растут коганская трава или японская кровавая трава, которые необходимо дифференцировать друг от друга.

Японскую кровавую траву легко отличить от дикого типа травы Коган по ее ярко-красным листьям. Однако реверсия японской кровавой травы почти неотличима от травы Коган, так как оба растения имеют более длинные зеленые листья, большую площадь листовой поверхности и более крупные корневища, чем декоративная японская кровавая трава. Данный метод может быть использован для анализа свежих, замороженных и недавно высушенных тканей листьев.

Если ткани предназначены для экстракции ДНК в более поздний срок, наилучшим методом является их немедленное замораживание и хранение при температуре минус 80 °C. В случае необходимости сухого хранения поместите ткань в бумажный конверт и храните конверт в дегидратированном силикагеле или других активных десикантах при комнатной температуре. При использовании свежей ткани убедитесь, что экстракция ДНК проведена в течение трех часов после сбора во избежание деградации.

В данной процедуре используется мини-набор DNEZ plants от Kyogen в соответствии с инструкциями производителя с одним небольшим изменением. Процедура была адаптирована для использования более 100 мг свежей или замороженной ткани или более 20 мг высушенной ткани. Сначала измельчите более 100 мг свежей или замороженной ткани листа или более 20 мг сухой ткани листа до состояния мелкого порошка, используя жидкий азот в три цикла при растирании в охлажденной ступке с пестиком.

Взвесьте замороженный порошок из свежей или замороженной ткани навесками по 100 milligram. При использовании сухой ткани листа взвесьте порошок навесками по 20 milligram. После этого этапа проведите экстракцию ДНК в соответствии с инструкциями производителя, используя спектрофотометр, например, тест на спектрофотометре NanoDrop; при хорошем выходе ДНК количество и качество должны составлять от 50 до 150 nanograms per microliter, а соотношения 260/280 и 230/280 должны быть близки к 2,0, как показано здесь.

Проведите электрофорез с использованием стандартного 1%AROS геля. Подтвердите наличие относительно крупных полос размером более 10 KB с минимальным или отсутствующим шлейфом из-за загрязнения РНК; если концентрация ДНК высока, разбавьте образцы до 70 nanograms per microliter для последующих этапов. ПЦР-праймеры, используемые в данном протоколе (отмечены красными и зелеными стрелками), основаны на различиях в последовательностях спейсерного региона LF в области заклепочного поворота генотипов Cogan grass и Japanese blood grass.

Эти различия представлены однонуклеотидными полиморфизмами, а также инсерциями и делециями, отмеченными вертикальными черными стрелками, что позволяет разработать праймеры, специфичные для конкретного сорта. Поскольку праймеры располагаются на участках уникальных последовательностей, их последовательности приведены в текстовой части протокола для каждого выделенного образца ДНК; проведите две ПЦР-реакции объемом 50 µL в тонкостенных ПЦР-пробирках объемом 0,2 mL на льду, используя каждый набор праймеров согласно письменному протоколу. При низкой концентрации ДНК в каждую реакцию можно добавить большее количество ДНК, скорректировав объем дважды дистиллированной воды, свободной от нуклеаз, таким образом, чтобы общий объем реакции оставался равным 50 µL.

Не используйте более 5 µL ДНК или более 10% от общего объема на одну реакцию, так как примеси, содержащиеся в образцах ДНК, могут ингибировать ПЦР-реакции. Чтобы убедиться в работоспособности всех ПЦР-реагентов, правильно подготовьте положительный контроль. Используя праймеры для положительного контроля, подготовьте отрицательный контроль, используя тот же набор контрольных праймеров, что и для положительного контроля, но с дважды дистиллированной водой вместо экстрагированной ДНК; на данном этапе для каждого тестируемого образца должно быть подготовлено в общей сложности четыре ПЦР-реакции. Затем проведите ПЦР-амплификацию в термоциклере с подогреваемой крышкой, используя параметры циклов ПЦР, указанные в письменном протоколе; в зависимости от качества ДНК, праймеров, Taq-полимеразы или типа используемого термоциклера может потребоваться оптимизация температуры отжига праймеров, времени элонгации и количества циклов.

После завершения реакций ПЦР разделяйте продукты ПЦР в 1% геле с помощью стандартного электрофореза. Проводите электрофорез образцов при напряжении около 120 вольт до тех пор, пока фронт ДНК не пройдет три четверти общей длины геля. Визуализируйте гель под УФ-светом и осмотрите полученные полосы, чтобы убедиться в амплификации соответствующего фрагмента ДНК.

На этом репрезентативном геле показаны результаты электрофореза ПЦР-продуктов, полученных из образцов ДНК когана (Kogan grass), японской кровяной травы (Japanese blood grass) и реверсии японской кровяной травы, с использованием специфичных праймеров для когана и JBG, а также положительного контроля turn LF и отрицательного контроля без матрицы. Набор праймеров положительного контроля turn LF одинаково эффективно работает для когана, японской кровяной травы, реверсии японской кровяной травы и других злаков, что приводит к образованию полосы размером 890 base pairs. Если все реагенты для ПЦР не содержат загрязнений ДНК, в результате реакции отрицательного контроля ПЦР-продукт не образуется.

Если образец ДНК получен из коганской травы дикого типа, ПЦР-реакция с использованием специфического набора праймеров для коганской травы приведет к появлению одной полосы размером около 595 пар оснований, в то время как при использовании специфических праймеров для JBG полоса будет отсутствовать. Аналогично, если образец ДНК получен из JBG или в результате обратной реакции J-B-G-A-P-C-R, использование специфического набора праймеров для JBG приведет к появлению одной полосы размером около 594 пар оснований, тогда как при использовании специфических праймеров для коганской травы полоса будет отсутствовать.

Поскольку JBG и ревертировавшие JBG имеют идентичную последовательность нуклеиновых кислот, они будут иметь одинаковые картины полос. Однако морфологические различия между JBG и ревертантами JBG довольно очевидны, поэтому, хотя результаты ПЦР будут одинаковыми, сорта JBG легко различить на уровне растения. Секвенирование ДНК ПЦР-продуктов позволяет выявить возможные изменения в последовательностях ДНК для различных экотипов коган-травы.

Разработка данного метода представляет собой первый упрощенный молекулярный способ, позволяющий точно отличить дикий тип японского злака от ревертированной формы его декоративного сорта — японской кровавой травы. Мы предлагаем пользователям данного протокола связаться с нами, чтобы сообщить о результатах, полученных при его применении. Обмен такой информацией поможет собрать данные о распространении японской кровавой травы.

Это также поможет регулирующим органам USDA принимать обоснованные решения о мерах, которые могут потребоваться для предотвращения распространения и потенциальной гибридизации высокоинвазивных разновидностей коганника.